نوع مقاله : مقاله پژوهشی
نویسندگان
1 استادیار، دانشگاه آزاد اسلامی واحد تاکستان، دانشکده علوم پایه، گروه شیمی، تاکستان، ایران
2 دانشجوی کارشناسی ارشد، گروه آموزشی فیتوشیمی و شیمی فناوری اسانس، دانشکده شیمی دارویی، واحد علوم دارویی دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
3 هیات علمی مرکز تحقیقات گیاهان دارویی، پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی
چکیده
کلیدواژهها
فصلنامه اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی، شماره پیاپی 27، سال هفتم، شماره 3، پاییز 1398
(مقاله کوتاه)
استخراج، جداسازی و تعیین ساختار شیمیایی گلیکوزید قلبی
دیگوکسین از عصارۀ گیاهLeonurus cardiaca L.
شبنم ارجمندی1، محبوبه طاهرخانی2*، مجید قربانی نهوجی3
1کارشناسارشد، گروه آموزشی فیتوشیمی و شیمی فناوری اسانس، دانشکده شیمی دارویی، واحد علوم دارویی دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران
2استادیار، گروه شیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی، تاکستان، ایران
3استادیار، مرکز تحقیقات گیاهان دارویی، پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی، کرج، ایران
تاریخ دریافت: 10/10/1396 تاریخ پذیرش: 22/05/1397
چکیده
گیاه دارویی دم شیر با نام علمی Leonurus cardiaca L. علفی و چند ساله متعلق به تیرۀ نعنائیان (Lamiaceae) میباشد که بهطور گسترده در طب سنتی ایران و دیگر کشورها بهعنوان گیاهی آرام بخش، خوابآور، مدر، کاهنده فشار خون، بهویژه در درمان بیماریهای قلبی استفاده میشود. از این گیاه ترکیبات فیتوشیمیایی مهمی نظیر آلکالوییدها، ایریدوییدها، ساپونینها، فلاونوییدها، کاردنولیدها و دی ترپنوییدها استخراج و شناسایی شده است. با توجه به اهمیت و پراکندگی این گیاه در ایران، این پژوهش به منظور جداسازی و تعیین ساختار فیتوشیمیایی گلیکوزید قلبی از عصارۀ گیاه دم شیر طراحی شد. برای انجام این تحقیق، اندامهای هوایی گیاه در مرحلۀ گلدهی از دامنههای کوه دماوند در مردادماه 1395 جمعآوری و به روش خیساندن در حلال عصارهگیری گردید. پس از چربی زدایی با حلال هگزان، از کروماتوگرافی ستونی برای جداسازی اجزای مختلف عصاره استفاده شد. در مجموع 32 ترکیب بدست آمد، یک ترکیب کریستالی طبیعی در فراکسیون 8+9+10 ظاهر گردید. ترکیب شیمیایی آن با استفاده از روشهای طیف سنجی (13C-NMR، 1H-NMR، DEPT و IR) شناسایی شد. بر اساس نتایج به دست آمده از طیف سنجی، این ترکیب طبیعی دیگوکسین، یک گلیکوزید قلبی شناخته شده است که برای اولین بار از این گیاه استخراج شد.
واژههای کلیدی:دم شیر، دیگوکسین، عصاره، کروماتوگرافی. [2]
مقدمه
گیاه Leonurus cardiaca L. با نام فارسی دم شیر، گیاهی معطر و دارویی و متعلق یه تیره نعنائیان (Lamiaceae) است که از دیرباز تاکنون در طب سنتی ایران و نقاط مختلف جهان جهت درمان اختلالات قلبی و عصبی مورد استفاده قرار میگیرد. این گیاه دارای اثرات آرام بخش، کاهنده استرس، اضطراب و فشار خون بوده و در درمان اختلالات نوروپاتیک و عملکردی قلبی مؤثر است (Gholipour, et al., 2014; Mozaffarian, 2012; Mil kowska-Leyck,et al.,2002). بر اساس اطلاعات ذکر شده در فارماکوپه اروپا، فارماکوپه شوروی سابق و فارماکوپه بریتانیا بخشهای هوایی گلدار کامل یا بریده خشک شده گیاهL. cardiaca که ویژگیهای فارماکولوژیکی قابل توجهی نیز دارد با واژه Herba Leonuri معرفی و نامگذاری میشود و دارای عطر زیاد و مزه تلخ میباشد (WHO, 2010).
این گیاه بومی اروپای مرکزی، اروپای شرقی، منطقه اسکاندیناوی، آسیای غربی و آسیای مرکزی بوده و در قفقاز و غرب سیبری نیز یافت میشود. امروزه این گیاه به صورت طبیعی در آمریکای شمالی نیز رشد میکند. همینطور از این گیاه به صورت کاشته شده نیز گزارشاتی ملاحظه شده است (Ewy, 2015; Fleming, 2000). برای این گیاه اثرات فارماکولوژیکی متعددی در زمینه بیماریهای قلبی- عروقی در آزمایشات مختلف سلولی و بالینی(Zhang, et al., 2018; Sermukhamedova, et al., 2017; Pang, et al., 2001; Bol’shakova, et al., 1997;
Zou, et al., 1989; Chan, et al., 1983; Racz-Kotilla, et al., 1981) و همچنین اثرات ضد توموری گزارش شده است (Nagasawa, et al., 1990). همچنین این گیاه دارای فعالیتهای آنتیاکسیدانی، ضدالتهابی و ضدمیکروبی نیز میباشد (Rezaee-Asl, et al., 2014; Sun, et al., 2005; Zhu, et al., 2004).
در این گیاه تاکنون بسیاری از ترکیبات موثره فیتوشیمیایی نظیر آلکالوئیدها، ایریدوئیدها[2]، ساپونین، فلاونوئیدها و بهویژه برخی از گلیکوزیدهای فنیل پروپانوئیدی همچون ترکیب Lavandulifolioside (که اثرات قابل توجهی بر عملکرد قلب، جریان کرونری و فشار خون داشته است) استخراج و شناسایی شده است (Shekari, et al., 2016;
Mil kowska-Leyck, et al., 2002).
گلیکوزیدهای قلبی ترکیبات دارویی هستند که برای درمان نارسایی قلب و آریتمی قلب به کار میروند. این گلیکوزیدها معمولاً به عنوان متابولیتهای ثانویه در برخی گیاهان گلدار نظیر گیاهان خانواده خرزهره (Apocynaceae)، گل میمون (Scrophulariaceae)، آلاله (Ranunculaceae) و چند خانواده دیگر یافت میشوند. از شناخته شدهترین گیاهان حاوی این نوع گلیکوزیدها میتوان به گیاه گلانگشتانه Digitalisspp. (حاوی دیجیتالین) و گیاه گل خروسک Adonis spp.(حاوی ترکیبات دیجیتالین، آدونین و آدونیتوکسین) اشاره نمود (Mozaffarian, 2012; Hosseini, et al., 2019).
قابل توجه این که گیاه دمشیر از طریق تسهیل جریان کرونری خون موجب کاهش فشارخون و تقویت قلب شده و همچنین اثرات آرام بخشی آن بواسطه کاهش اختلالات عصبی و عملکردی قلب در کاربرد سنتی گیاه گزارش شده است. همچنین از این گیاه در رفع مشکلات قلبی ناشی از تنشهای عصبی و هیپرتیروئیدیسم استفاده شده و بهبود تاکیکاردی ناشی از هیپرتیروئیدیسم و اختلالات گوارشی، آسم، برونشیت، علائم بالینی مربوط به آنها و نیز بهبود زخمها و ناراحتیهای پوستی از جمله اثرات درمانی گیاه L. cardiaca میباشد. این گونه اثرات دارویی را میتوان به حضور ترکیبات گلیکوزید قلبی موجود در پیکره گیاه مرتبط دانست (Blumenthal, et al., 2000; Bradley, 1992). همچنین اثرات محافظتی بر قلب و اعصاب همراه با ویژگیهای آنتی دیابت، آنتیاکسیدان، حشرهکش و سیتوتوکسیک برای گیاه Digitalis lanata (گل انگشتانه)گزارش شده است. برای اثرات قلبی عروقی مورد اشاره در گیاه گل انگشتانه بیشترین اثر به حضور ترکیبات digoxin و digitoxin که از جمله ترکیبات گلیکوزید قلبی هستند نسبت داده میشود. بیان میشود که این اثر بیشتر از طریق مهار فعالیت آنزیم ATPase و تنظیم میزان غلظت کلسیم سیتوپلاسمی رخ میدهد (Al-Snafi, 2017).
با توجه به بررسیهای صورت گرفته، در قسمتهای هوایی گیاه دارویی L. cardiaca ، مواد تشکیل دهنده متنوعی متعلق به گروه ترپنها شامل مونوترپنهایی نظیر ایریدوییدها (Weinges, et al., 1973)، دیترپنهایی نظیر کلرودان (Brieskorn and hofmann, 1979)، فورانولابدان و سایر انواع لابدانها (Agnihotri, et al., 2008)، تریترپنهایی از جمله اسیدهای ursolic وoleanolic (Ali et al., 2007; Janicsák et al., 2006) ترکیبات حاوی نیتروژن مانند leonurine (Ewy, 2015; Winnicka, et al., 2006; Chen, et al., 2000) و stachydrine (Ewy, 2015; Calderon-Montano, et al., 2014; Gulubov and Chervenkova, 1970) و فنیل پروپانوئیدهایی مانند lavandulifolioside (Mil kowska-Leyck, et al., 2002) و همچنین فلاونوئیدها (Jafari, et al., 2010)، اسیدهای فنولیک (Bernatoniene, et al., 2009)، در اپی- سِدرول (7/9 درصد)، آلفا-هومولن (2/9 درصد)، دِهیدرو-1و8-سینئول (9/8 درصد)، ژرماکرن –دی (9/8 درصد) و اسپاتولنول (8/8 درصد) در روغن فرار (Morteza-Semnani, et al., 2008)، استرولها (Senatore, et al., 1991) و تاننها یافت میشود. گزارشهای فارماکولوژیک متعددی در مورد اثرات ضد میکروبی (Agnihotri, et al., 2008; Sattar, et al., 1995)، ضد التهابی (Ali et al., 2007) و آنتیاکسیدانی (Jafari, et al., 2010; Bernatoniene, et al., 2009) این گیاه وجود دارد. همچنین برخی تحقیقات انجام شده اثرات مفید گیاه بر قلب و سیستم گردش خون و خواص ضدسرطانی این گیاه دارویی ارزشمند را به خوبی نشان داده است (Rezaee-Asl, et al., 2014; Mil kowska-Leyck, et al., 2002).
فلاونوئیدها اجزای اصلی بخشهای هوایی این گیاه هستند که از آن جمله میتوان به ترکیبات زیر اشاره کرد: O-گلیکوزیدهای کوئرستین (از جمله روتین، کوئرستین، ایزوکوئرستین، هیپروزید)، کامپفرول، آپیژنین (بهصورت مشتقات آپیژنین شامل ژنکوانین و کوئین کوئلوزید)، آلکالوئیدها
((-)-استاکیدرین و لئونورین)، گلوکوزیدهای ایریدوئید (لئونورید، آژوگول، گالیریدوزید، و رپتوزید)، دی ترپنوئیدها (لئوکاردین، مخلوطی از 2 مشتق کلرودان)، سیکلولئونوری پپتیدها (A، B، C و D)، تریترپنها (اورسولیک اسید)، گلیکوزیدهای تلخ، کافئیک اسید 4-روتینوزید، و تاننها (Zhang et al., 2018; Sermukhamedova et al., 2017; Fleming, 2000; Bradley, 1992; Weinges, et al., 1973) علاوه بر آنچه ذکر شد ترکیبات مونوترپن، دیترپن، تریترپن، فلاونوئیدها، فنیل پروپانوئیدها، اسیدهای فنولیک، ترکیبات حاوی نیتروژن، روغنهای فرار، استرولها و تاننها نیز در این گیاه وجود دارند (Wojtyniak, et al., 2013). همچنین این گیاه دارای فلاونوئیدهای کوئرستین (Ritter et al., 2010; Mockute et al., 2006)، کامپفرول (Kartnig et al., 1985)، ترپنوئید ursolic acid و واجد خاصیت آنتی اکسیدانی قابل توجه میباشد (Trumbeckaite, et al., 2006). همچنین جرمکرن D با غلظت 6/26 تا 1/35 درصد بیشترین غلظت را در روغن اسانسی گیاه
L. cardiaca جمعآوری شده از لیتوانی به خود اختصاص داده بود، پس از آن ترکیبات بتا کاریوفیلن (0/9-8/5 درصد) و آلفا-هومولن (2/9-4/6 درصد) بهترتیب بیشترین غلظت را به خود اختصاص داده بودند (Mockute et al., 2006).
عصاره گیاه L.cardiaca ویژگیهای آنتیاکسیدانی و محافظت قلبی[3] داشته و بر ایسکمی میوکارد قلب اثر دارد. اثرات آنتیاکسیدانی به دو صورت in vitro و in vivo نیز برای عصاره این گیاه ثابت و نشان داده شد که این اثر با حفاظت انتخابی فعالیت سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز اتفاق میافتد (Feng et al., 2017; Sun et al., 2005). اثرات آنتیاکسیدانی قابل توجهی از این گیاه در طب سنتی چین گزارش شده و با روش آزمایشگاهی رایج مثل ABTS و DPPH تایید شده است (Zhu et al., 2004). در مطالعه دیگری نشان داده شد که عصارۀ آبی گیاه
L. cardiaca جهت درمان ناراحتیهای قلبی مورد استفاده قرار میگیرد. همچنین این گیاه دارویی دارای خاصیت سوپراکساید دیسموتازی و پراکسیدازی بوده و دارای اثر بازدارندگی در پراکسیداسیون چربیها میباشد (Ji et al., 2017). اثرات این گیاه بهعنوان عاملی موثر بر کاهش غلظت خون اثبات شده است (Zou et al., 1989).
با توجه به اثرات دارویی و جایگاه مهم گیاه
L. cardiacaدر طب سنتی ایران و کشورهای مختلف و همچنین با توجه به اثرات دارویی و فارماکولوژیکی گلیکوزیدهای قلبی، لزوم انجام تحقیقات وسیعتر در این زمینه احساس میگردد. لذا با در نظر گرفتن این موضوع که تاکنون مطالعهای در خصوص شناسایی ترکیبات موثره عصاره این گیاه در ایران انجام نشده است، هدف از این تحقیق بررسی فیتوشیمیایی عصاره این گیاه خودرو در کشور میباشد.
مواد و روشها
تهیه نمونه گیاهی: اندامهای هوایی گیاه دم شیر
L. cardiaca در مرحلۀ گلدهی از محل رویش طبیعی خود واقعدر دامنۀ کوه دماوند در استان مازندران با ارتفاع 3170 متر از سطح دریا و مختصات جغرافیایی N: 35▫ 54´ 42˝ و E: 52▫ 06´ 40˝ در تابستان سال 1395 جمعآوری شد. گیاه اشاره شده پس از خشک و پرس شدن به پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی منتقل گردیده و بعد از تهیه نمونه های استاندارد هرباریومی با استفاده از منابع معتبر گیاهشناسی کشور به دقت شناسایی گردید. نمونه هرباریومی گیاه مورد مطالعه با کد و شماره هرباریومی 7006-IMPH در هرباریوم پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی ثبت و مستندسازی گردید. حجم بیشتری از گیاه جمعآوری شده در طبیعت نیز بعد از خشک کردن در سایه و خرد کردن توسط آسیاب برای عصارهگیری آماده گردید.
مواد شیمیایی و معرفها: کلیۀ مواد شیمیایی، سیلیکاژل، حلالها و استانداردهای استفاده شده از شرکتMerck خریداری گردید.
دستگاهها: جهت توزین نمونه گیاهی از ترازوی دیجیتال مدل Shimadzu-AX200 ژاپن و جهت تغلیظ عصاره در هر مرحله از دستگاه تبخیرکن دوار (روتاری) مدل Rotavapor-R200 ساخت شرکت Buchi آلمان استفاده شد. طیف NMR توسط دستگاه رزونانس مغناطیسی هسته با شدت 400 مگاهرتز مدل Bruker آلمان در دانشگاه زنجان و طیف IR نیز با استفاده از دستگاه FT-IR ساخت شرکت Shimadzu موجود در دانشگاه زنجان گرفته شد.
عصارهگیری و چربیگیری: برای تهیه عصاره از این گیاه به روش ماسراسیون، ابتدا 800گرم از اندامهای هوایی گیاه در سایه کاملاً خشک شده و سپس خرد گردید. سپس پودر همگن آماده شده برای استخراج ترکیبات طبیعی موجود در گیاه، به مدت 48 تا 72 ساعت در مخلوط متانول: دی اتیل اتر: نرمال هگزان به نسبت 1:1:1 در یک تانک در تاریکی خیسانده شد. پس از سپری شدن زمان لازم مخلوط حاصل با استفاده از قیف بوخنر و پمپ خلأ صاف شده و محلول باقی مانده توسط دستگاه روتاری تغلیظ شد. در نهایت عصارهای به رنگ سبز تیره و به صورت شیرهای غلیظ و ویسکوز حاصل گردید. سپس به منظور جدا نمودن چربیها، عصاره با میزان بسیار کمی از متانول حل و به همراه آب مقطر به دکانتور منتقل شد. سپس طی چند مرحله تا حذف کامل چربی ها توسط حلال هگزان در دکانتور، چربیگیری گردید. سپس جهت جدا نمودن ترکیبات طبیعی از حلال اتیل استات استفاده شد. در مرحله بعد فازهای اتیل استات توسط دستگاه روتاری تغلیظ و جذب سیلیکاژل گردید (Taherkhani and Rustaiyan, 2016).
کروماتوگرافی: برای آماده کردن ستون کروماتوگرافی، مقدار لازم از سیلیکاژل مخصوص کروماتوگرافی ستونی با مش 400-230 همراه با حلال هگزان مخلوط و به ستون کروماتوگرافی اضافه شد. نهایتاً عصارهای که جذب سیلیکاژل شده بود به ستون اضافه گردید. برای جداسازی ترکیبات موجود در عصاره با پلاریتههای مختلف، ستون به ترتیب با حلالهای هگزان، اتیل استات و متانول (غیر قطبی، نیمه قطبی و قطبی) با نسبتهای مشخص مطابق با جدول شمارۀ 1 شست و شو شده و در اتمام کار 32 فراکسیون به دست آمد. پس از گذشت چند روز در فراکسیون های 8+9+10 و11 بلورهایی مشاهده گردید.بلور به دست آمده از فراکسیون 8+9+10 خالص سازی، جداسازی و برای شناسایی ساختار ترکیب طبیعی موجود در آن طیف H NMR1،C NMR 13، DEPT و IR گرفته شد.
جدول 1: نسبت حلال های مورد استفاده برای شستشوی ستون اول
هگزان(ml) |
اتیل استات(ml) |
100 |
0 |
90 |
10 |
80 |
20 |
70 |
30 |
60 |
40 |
50 |
50 |
40 |
60 |
30 |
70 |
20 |
80 |
10 |
90 |
0 |
100 |
متانول(ml) |
اتیل استات(ml) |
2 |
98 |
5 |
95 |
10 |
90 |
15 |
85 |
20 |
80 |
30 |
70 |
40 |
60 |
50 |
50 |
60 |
40 |
70 |
30 |
80 |
20 |
90 |
10 |
100 |
0 |
نتایج
ساختار ترکیب شناسایی شده از عصارۀ گیاه Leonurus cardiaca: نتایج حاصل از طیفهای بدست آمده حضور یک ترکیب طبیعی از نوع گلیکوزیدهای قلبی را نشان داد که ساختار آن در شکل 1 آورده شده است.
شکل 1: ساختار ترکیب دیگوکسین یک گلیکوزید قلبی استخراج شده از گیاه L. cardiaca
بررسی طیفهای حاصل از ترکیب شناسایی شده از عصارۀ گیاه Leonurus cardiac: نتایج حاصل از طیفهای بدست آمده از ترکیب طبیعی حاصله در شکلهای 2 تا 7 آورده شده است.
شکل 2: طیف کلی 1H-NMR ترکیب دیگوکسین استخراج شده از عصارۀ گیاهL. cardiaca
در شکل 2 شمای کلی طیف 1H-NMR دیده میشود که در شکلهای 3 و 4 بهترتیب بزرگنمایی آن آورده شده است. همانطور که دیده میشود این ترکیب طبیعی نوعی گلیکوزید کاردیاک با اسکلت و شماره گذاری شکل 1 میباشد.
شکل 3: بزرگنمایی طیف 1H-NMR ناحیه 0 تا ppm3 دیگوکسین استخراج شده از عصارۀL. cardiaca
شکل 4: بزرگنمایی طیف 1H-NMR ناحیه 3 تا ppm6 دیگوکسین استخراج شده از عصارۀL. cardiaca
همانطور که در تصاویر ملاحظه میگردد متیلهای 18 و 19 به صورت سینگلت و هر کدام با انتگرال 3 در ناحیه ابتدایی طیف و زیر دلتای یک ظاهر شدهاند. همچنین به دنبال آنها متیلهای قندی یعنی ́6 ، ́ ́6 و ́ ́ ́6 به همراه دو هیدروژن b11 و a7 با انتگرال 11 هیدروژن در دلتای 1 تا 2/1 ظاهر شدهاند. به تعداد 16 هیدروژن به صورت overlapped در ناحیه 3/1 تا 2 مربوط به هیدروژنهای آلکانی و سیکلو آلکانی میباشد که به اتم اکسیژن متصل نمیباشند. پیک حلال DMSO در ناحیه 54/2 و بدون انتگرال آمده است.همانطور که ملاحظه میشود پروتون های قندی یعنی ́4 ، ́ ́4 و ́ ́ ́4 که به اتم اکسیژن متصل میباشند در دلتای حدود 3 تا ppm15/3 با شکافتگیهای خود آمدهاند. پروتون 12 که به اتم اکسیژن متصل است در کنار پروتون آلیلی شماره 17 با انتگرال 2 در ناحیه حدود ppm 24/3 قابل رؤیت است. در ناحیه حدود ppm 4/3 پیک آب موجود در حلال به صورت سینگلت و بدون انتگرال قابل مشاهده است. پیک مربوط به پروتونهای قندی یعنی ́5 ، ́ ́5 و ́ ́ ́5 که به اتم اکسیژن متصل میباشند در دلتای حدود 6/3 تا ppm 8/3 با انتگرال 3 و به دنبال آن پیک مربوط به هیدروژن شمارۀ 3 و ́3 ، ́ ́3 و ́ ́ ́3 ظاهر شدهاند. بنابراین هیدروژنهایی که به دلیل اتصال به اتم الکترونگاتیو اکسیژن نپوشیده شده بودند را در ناحیه 3 تا ppm5 مشاهده نمودیم. از ناحیه 1/4 تا 65/4 ppm، پروتونهای مربوط به 6 گروه هیدروکسیل ظاهر شدهاند. هیدروژن شمارۀ ́1 ، ́ ́1 و ́ ́ ́1 که از دو جهت به اکسیژن متصل هستند نپوشیدهتر شده و با انتگرال 3 در دلتای حدود 76/4 تا 85/4 ظاهر شدهاند. هیدروژن های 21 و ́21 موجود در حلقۀ لاکتونی در دلتای حدود 90/4 تا ppm 94/4 با انتگرال 2 قابل مشاهدهاند. نپوشیدهترین پروتون مربوط به هیدروژن باند دوگانه یعنی 22 میباشد که در دلتای ppm 83/5 به صورت سینگلت دیده میشود.
شکل 5: طیف کلی 13C-NMR دیگوکسین استخراج شده از عصارۀL. cardiaca
شکل 6: بزرگنمایی طیف 13C-NMRناحیه 0 تا ppm85 دیگوکسین استخراج شده از عصارۀL. cardiaca
طیف 13C-NMRبه همراه بزرگنمایی آن در شکل 5 و 6 بهصورت مقایسهای قابل مشاهده است. همانطور که در شکل دیده میشود کربنهایCH و CH3 بهصورت سر بالا و کربنهای CH2 به صورت سر پایین در طیف DEPT قابل رؤیت است و کربنهای نوع چهارم نیز در این طیف ظاهر نمیگردند. در طیف 13C-NMRنیز 41 پیک مربوط به 41 کربن مطابق با فرمول بسته ظاهر شده است. مطابق با شکل 6 در دلتای زیر ppm 60 کربنهای آلکانی و سیکلوآلکانی که به اتم اکسیژن متصل نیستند ظاهر شدهاند. سپس کربنهای متصل به اتم الکترونگاتیو اکسیژن از دلتای ppm 66 به بالا قابل رؤیت هستند. کربنهای شمارۀ ́1 ، ́ ́1 و ́ ́ ́1 که از دو جهت به اکسیژن متصل هستند نپوشیدهتر شده و در دلتای حدود 95 تا 99 ظاهر شدهاند. کربن 22 مربوط به باند دوگانه در حلقۀ لاکتونی در دلتای حدود ppm 116 ظاهر شده است. نپوشیدهترین کربنها مربوط به کربونیل شمارۀ 23 و کربن مزدوج مربوط به باند دوگانه 20 است که در دلتای ppm 174 و 177 بهترتیب دیده میشوند.
شکل 7: طیف IR ترکیب دیگوکسین استخراج شده از عصارۀL. cardiaca
تفسیر طیفIR وجود گروه های عاملی زیر را در ساختار این ترکیب اثبات مینماید:
83/3421 تا 91/3446ß OH هیدروکسیل
76/2935 تا 60/2885 ß =C-H ارتعاشی کششی
92/1737 ß C=O ارتعاشی کششی کربونیل
24/1051 و 09/1028 و 02/1003 ß C-O ارتعاشی کششی
27/1267 ß C-C ارتعاشی کششی
91/1656 ß C=C ارتعاشی کششی
بحث
امروزه گونههای مختلفی از گیاه گل انگشتانه (Digitalis spp.) بهعنوان منبع اصلی جهت استخراج ترکیبات گلیکوزید قلبی از گروه digitoxin ها شناخته میشوند. در سال 1785 ترکیب دیگوکسین برای اولین بار از این گیاه توسط ویلیام ویدرینگ کشف و گزارش کرد. در این مطالعه اشاره شد که دیگوکسین نمونهای از یک داروی محرک قلبی است که باعث افزایش قدرت انقباض قلب و در عین حال کاهش سرعت ضربان قلب میگردد. همچنین دارای اثرات اینوتروپیک مثبت و الکترولیتی در سلول است و بر اساسِ این اثرات، برای درمان دو اختلال مهم بالینی یعنی نارسایی قلبی CHF (به علت اختلاف سیستولیک) و آریتمی های فوق بطنی به طور وسیعی مورد استفاده قرار میگیرد (Zhang et al., 2008; Withering, 1785).
مطالعه عصارهگیری و استخراج جهت دستیابی به گلیکوزیدهای قلبی، برای اولین بار در گیاه Digitalis و در سال 1950 صورت پذیرفت. در این مطالعه نشان داده شد که استفاده از عصاره آبی همراه با استفاده از یکسری حلالهای با قطبیت متفاوت منجر به استخراج ترکیبات گلیکوزیدی گروه Digitalin نظیر دیگوکسین و دیجیتالین میگردد (Ewy, 2015; King and Gisvold, 1950).
در مطالعه دیگری که بر روی گیاه D. lanata و با استفاده از تکنیک HPLC انجام شد، برای نخستین بار قادر به شناسایی برخی ترکیبات گلیکوزید قلبی و از جمله دیگوکسین شدند. در این روش عصارهگیری که توسط آب و آب- الکل انجام شد، نشان داده شد که روش عصارهگیری هیدروالکلی از روشهای قبلی توصیف شده بهتر بوده و راندمان و عملکرد بهتری دارد. برخی ترکیبات گلیکوزیدی از جمله دیگوکسین در این روش در ستونReversed Phase با استفاده از مخلوط متنوعی از حلالها در فاز متحرک بهدلیل داشتن نقاط ایزوکراتیک متفاوت جدا شدند. این کار در زمان ذکر شده برای اولین بار صورت گرفته و نشان داد که استفاده از الکل (بهعنوان یک حلال قطبی) در عصاره گیری، راندمان استخراج دیگوکسین را افزایش میدهد (Ewy, 2015; Orosz et al., 1989). بر اساس همین روش و نتیجهگیریها در مطالعه حاضر نیز تلاش شد تا از گیاه دم شیر
(L. cardiaca) که ویژگیهایی در مورد رفع بیماریهای قلبی-عروقی برای آن در متون طب سنتی و مدرن ذکر شده است، با استفاده از حلالهای آلی با قطبیتهای متفاوت عصارهگیری صورت گرفته و تلاش شد تا با حذف حلال قطبی آب بازده استخراجی مواد موثره افزایش یابد.
در مطالعات سالهای اخیر نشان داده شد که استخراج digoxin با استفاده از روش نیمه بحرانی امتزاجی از CO2 و متانول (Near super critically mixture of CO2 and Meoh) اثرات بسیار بیشتری بر استخراج این ماده موثره داشته است. در واقع نشان داده شده که میزان آب باقیمانده در بافت گیاه به دلیل اختلالی که از جهت قطبیت با digoxin دارد مانع از استخراج کامل و بازده مناسب روشهای قبلی میشود. در روشهای قبلی یا از عصاره آبی و یا از عصاره هیدروالکلی استفاده میشد. در هر دو صورت آب موجود در بافت گیاه باعث کاهش بازده استخراج میگردید. اما در این روش به دلیل حذف کامل آب (به عنوان یک حلال قطبی) میزان و راندمان استخراج دیگوکسین افزایش چشمگیری داشته است (Ewy, 2015; Moore and Taylor, 1996). در مطالعه حاضر نیز بر همین اساس تلاش شد تا جهت افزایش راندمان استخراج دیگوکسین از حلالهای آلی با قطبیتهای متفاوت استفاده شود.
همچنین در مطالعه دیگری که به روش پرکولاسیون جهت استخراج و خالص سازی دیگوکسین انجام شد از برگهای تخمیر شده گیاه
D. lanataاستفاده گردید و شرایط بهینه جهت استخراج و سپس جداسازی دیگوکسین مشخص شد. در بهترین شرایط غیر هوازی برای تخمیر گیاه در 37 درجه سانتیگراد بیشترین میزان استخراج دیگوکسین به میزان 99-100 درصد مشخص گردید. در نتیجه این مطالعه بهترین شرایط برای استخراج دیگوکسین توسط روش پرکولاسیون توصیف شده و میزان استخراج دیگوکسین با موفقیت 97 درصد گزارش گردید. در این مطالعه استفاده از روش پرکولاسیون با رعایت شرایط ذکر شده توصیه گردید و اشاره شد که راندمان استخراج در این روش حدود 30 درصد نسبت به روشهای رایج دیگر در عصارهگیری بیشتر میباشد (Novkovic et al., 2014). هرچند در مطالعه حاضر استفاده از روش عصاره گیری پرکولاسیون مقدور نبود اما با در نظر گرفتن سایر شرایط بهینه سازی برای استخراج حداکثری ماده موثره دیگوکسین در این مطالعه، از روش جایگزین ماسراسیون جهت تهیه عصاره استفاده شد و نتایج حاصله نیز بیانگر موفقیت نسبی جهت استخراج ترکیب دیگوکسین میباشد.
در مورد گیاه دمشیر (L. cardiaca) تاکنون مطالعات بسیار معدودی انجام شده است. به طور مثال در یک مطالعه مشابه، با استفاده از تکنیکهای طیفسنجی NMR و طیفجرمی MS، از عصارۀ بوتانولی گیاه Leonurus cardiaca var. vulgaris که محل رویش آن لهستان بوده است یک ترکیب گلیکوزید فنیل پروپانوئیدی به نام Lavandulifolioside با خاصیت کاهندگی فشارخون و اثرات قابل توجه بر جریان کرونری خون و عملکرد قلب استخراج، شناسایی و تعیین ساختار مولکولی شد (Mil kowska-Leyck et al., 2002). همانطور که ملاحظه میشود ترکیبی که در نتیجه مطالعه حاضر استخراج، شناسایی و معرفی شده است ترکیبی متفاوت از مطالعه فوق الذکر میباشد. دلیل این امر را میتوان ناشی از اختلاف در مناطق رویشی گیاهان و اقلیمهای متفاوت آنها که منجر به سنتز ترکیبات مختلف در پیکره گیاه میشود دانست. همچنین با احتمال قویتر این اختلاف مشاهده شده را میتوان ناشی از اختلاف در روش عصارهگیری و حلالهای مورد استفاده دانست.
در مطالعهای دیگر، از عصارۀ گیاه داروییL. cardiaca در اروپا (لیتوانی)، ترکیبات پلیفنولی و فلاونوئیدی نظیر کوئرستین، لوتئولین، کامفرول، روتین، chlorogenic acid، orientin، hyperoside و... جداسازی شده است (Bernatoniene et al., 2014). بهطور مشابه در مطالعه دیگری که بر روی عصارۀ اتانولی گیاه دارویی L. cardiaca در آلمان انجام شد نتایج حاصله نشان داد که عصاره گیاه غنی از ترکیبات فنولی مانند کافئیک اسید و فنیلاتانوئیدی بوده و خاصیت ضد التهابی و لاکتوپراکسیدازی قوی نشان داد (Flemmig et al., 2015). مقایسه نتایج حاصله در این مطالعه با نتایج تحقیقات مذکور نشان میدهد که هیچ گونه ترکیب گلیکوزید قلبی از جمعیتهای اروپایی این گیاه گزارش نشده است. علت این امر را نیز میتوان در نفاوتهای ناشی از اقلیم مناطق و همچنین در روشها و حلالهای متفاوت در تهیه عصاره دانست. با این توجه میتوان بیان کرد که گزارش ترکیب گلیکوزید قلبی دیگوکسین در این گونه از ایران برای اولین بار در دنیا انجام میگردد.
نتیجهگیری نهایی
برای اولین بار در دنیا از عصاره گیاه دم شیر (Leonurus cardiaca L.) یک ترکیب گلیکوزید قلبی به نام Digoxin با فرمول مولکولی C41H64O14 توسط تکنیک کروماتوگرافی ستونی استخراج و با استفاده از تکنیکهای طیف سنجی 13C-NMR، 1H-NMR، DEPT و IR شناسایی شده و ساختار مولکولی آن نیز تعیین گردید. این گیاه یک گیاه علفی چند ساله از تیره نعنائیان بوده و به صورت طبیعی در ایران رویش دارد. کاربردهای محلی مختلفی نیز از این گیاه در مطالعات مختلف گزارش شده است. با توجه به اینکه این گیاه در طب سنتی ایران و سایر کشورها جهت کاهش فشار خون و درمان بیماریهای قلبی مورد استفاده وسیعی قرار میگرفته و از این نظر تاحدودی گیاهی شناخته شده است، لذا میتوان این اثر را به وجود ترکیب digoxinدر گیاه مرتبط دانست.
آنچه که مسلم است در نتیجه این مطالعه میتوان بیان کرد که علاوه بر گیاه گل انگشتانه (که بهطور سنتی به عنوان منبعی برای ترکیبات گلیکوزیدی قلبی و بویژه digoxin شناخته میشود)، امروزه میتوانیم گیاه L. cardiaca (دم شیر) را نیز بهعنوان منبع جدیدی برای ترکیب digoxin معرفی نماییم. همچنین انجام تحقیقات بیشتر برای کشف ترکیبات طبیعی از جمله سایر گلیکوزیدهای قلبی به همراه ارزیابی اثرات بیولوژیکی آنها در عصاره این گیاه توصیه میگردد.
سپاسگزاری
از دانشکده شیمی دارویی، دانشگاه آزاد اسلامی
واحد علوم دارویی به دلیل در اختیار گذاشتن امکانات آزمایشگاهی و از پژوهشکده گیاهان دارویی جهاد دانشگاهی جهت همکاری در راستای شناسایی، معتبر سازی گیاه و اطلاعات گیاه شناسی تشکر میگردد.
References
Eco-phytochemical Journal of Medicinal Plants, 7th Year, Volume Three, Autumn 2019
(Short Paper)
Extraction, isolation and chemical structure determination of Digoxin cardiac glycoside from Leonurus cardiaca L.extract
Arjmandi, Sh.1,Taherkhani, M.2*, Ghorbani Nohooji, M.3
1M.Sc. Student, Dept. of Phytochemistry and Essential Oils Technology, Faculty of Pharmaceutical Chemistry, Pharmaceutical Sciences Branch, Islamic Azad University (IAUPS), Tehran, Iran
2Assistant Professor, Dept. of Chemistry, College of Science, Takestan Branch, Islamic Azad University, Takestan, Iran
3Assistant Professor, Medicinal Plants Research Center, Institute of Medicinal Plants, ACECR, Karaj, Iran
Received: 2017-12-31 ; Accepted: 2018-8-13
Abstract
Leonurus cardiaca L., commonly known as “lion's tail”, is an herbaceous perennial medicinal plant belonging to Lamiaceae that is widely used in traditional medicine of Iran and other countries as a sedative, hypnotic, diuretic and hypotensive, especially for treating heart diseases. Important phytochemicals such as alkaloids, iridoids, saponins, flavonoids, cardenolides and diterpenoids have been previously extracted and identified from this plant. Due to the importance and distribution of this plant in Iran, this study was designed to isolate and determine the phytochemical structure of cardiac glycoside from Leonurus cardiaca L. extract. To conduct this study, the aerial parts of the plant were collected at flowering stages from hillsides of Damavand Mountain in August 2016 and extracted by maceration method. After defatting the extract with hexane solvent, chromatography column was used to separate the different constituents of the extract. Totally 32 different fractions were isolated; a natural crystal compound was appeared in fraction 8+9+10 of 10 + 9 + 10. Its chemical structure was identified using spectrophotometric methods (1H-NMR, 13C-NMR, IR and DEPT Techniques). Based on the obtained spectra, this natural compound was Digoxin, a well-known cardiac glycoside that was extracted from this plant for the first time.
Keywords: Chromatography, Digoxin, Extract, Leonurus cardiaca.[4]