بررسی اثر ضدقارچی اسانس چهار گیاه دارویی، آنالیز و شناسایی ملکولی باکتری آنتاگونیست علیه قارچ عامل پوسیدگی بعد از برداشت پرتقال Penicillium digitatum

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه علمی کاربردی خانه کارگر

2 دانشگاه علوم تحقیقات تهران

3 مرکز تحقیقات کشاورزی

4 عضو هیات علمی دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرگان

5 دانشگاه کاتانیا ایتالیا

چکیده

کپک سبز مرکبات  Penicillium digitatumازمهم‎ترین بیماری‌های بعد از برداشت می‌باشد. به کارگیری مداوم سموم شیمیایی تاثیر ماندگار روی سلامتی انسان و آلودگی محیط زیست دارد و سبب بروز مقاومت در سویه‌های بیماری‎زا می‏گردد. در این تحقیق فعالیت ضدقارچی غلظت‌های مختلف (100، 200، 300 و 400 پی‌پی‌ام) اسانس چهار گیاه دارویی آویشن شیرازی (Thymus vulgaris)، آلوورا (Aloe vera)، سیر (Allium sativum) و زیره سبز (Cuminum cyminum) جمع‌آوری شده از منطقه قرق استان گلستان مورد بررسی قرار گرفت. اسانس‌ها با استفاده از روش تقطیر؛ بخار آب و با استفاده از دستگاه کلونجر تهیه و سپس مهمترین مواد موثره اسانسی که بیشترین عملکرد آنتاگونیستی را داشتند توسط دستگاه GC/MS آنالیز گردید. همچنین فعالیت آنتاگونیستی باکتری‌های جداسازی شده از اپی‎فیت پرتقال شامل sp. Bacillus، Pseudomonassp.، Streptomycess sp. علیه قارچ پنی سیلیوم در قالب طرح فاکتوریل مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین درصد ممانعت کنندگی (95/99 درصد)، توسط اسانس آویشن علیه پنی سیلیوم در غلظت 400 پی‎پی‎ام مشاهده گردید. آنالیز رگرسیونی تاثیر اسانس‌ها نشان داد با افزایش غلظت اسانس درصد بازدارندگی آن روی قارچ افزایش می‌یابد. بر اساس نتایج به دست آمده، اسانس آویشن با داشتن مهمترین ترکیبات موثره در اسانس‌ها (کارواکرول - 5/45 درصد)، آلفا- ترپینئول (-9/22 درصد) و اندو- بورنئول (3/14 درصد) بیشترین فعالیت ممانعت کنندگی (3/22 میلی‌متر) را علیه پنی سیلیوم از خود نشان داد. در بین 23 جدایه باکتریایی، یک جدایه به نام H7 بیشترین فعالیت ممانعت کنندگی را علیه قارچ داشت. با استفاده از PCR و تعیین توالی DNA ژنوم 16S rRNA، H7 به‌عنوان Bacillus cereus شناسایی گردید. بنابراین اسانس آویشن و جدایه (Bacillus cereus (H7 جایگزین‌های مناسبی برای کنترل شیمیایی پوسیدگی بعد از برداشت پرتقال می باشند.

کلیدواژه‌ها


 

 

فصلنامه اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی، شماره پیاپی 27، سال هفتم، شماره 3، پاییز 1398

 


بررسی اثر ضدقارچی اسانس چهار گیاه دارویی، آنالیز و شناسایی ملکولی باکتری

آنتاگونیست علیه قارچ عامل پوسیدگی بعد از برداشت پرتقال Penicillium digitatum

 

شروین‌هادیان1، نادر حسن‌زاده2*،محمدعلی آقاجانی3، حمیدرضاپردلی4،گابریلا سیرولری5

1دانشجوی دکتری، گروه گیاهپزشکی، دانشکده علوم کشاورزی و صنایع غذائی، واحد علوم و تحقیقات دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

2دانشیار، گروه گیاهپزشکی، دانشکده علوم کشاورزی و صنایع غذائی، واحد علوم و تحقیقات، دانشگاه آزاد اسلامی، تهران، ایران

3دانشیار، بخش تحقیقات گیاهپزشکی، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی استان گلستان، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، گرگان، ایران

4استادیار،گروه میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد گرگان، ، ایران

5استاد،گروه علوم و فنون گیاه شناسی، بخش بیماری شناسی گیاهی، دانشگاه کاتانیا، ایتالیا

 

تاریخ دریافت: 15/12/1397  تاریخ پذیرش: 11/09/1398

چکیده

کپک سبز مرکبات  Penicillium digitatumازمهم‎ترین بیماری‌های بعد از برداشت می‌باشد. به کارگیری مداوم سموم شیمیایی تاثیر ماندگار روی سلامتی انسان و آلودگی محیط زیست دارد و سبب بروز مقاومت در سویه‌های بیماری‎زا می‏گردد. در این تحقیق فعالیت ضدقارچی غلظت‌های مختلف (100، 200، 300 و 400 پی‌پی‌ام) اسانس چهار گیاه دارویی آویشن شیرازی (Thymus vulgaris)، آلوورا (Aloe vera)، سیر (Allium sativum) و زیره سبز (Cuminum cyminum) جمع‌آوری شده از منطقه قرق استان گلستان مورد بررسی قرار گرفت. اسانس‌ها با استفاده از روش تقطیر؛ بخار آب و با استفاده از دستگاه کلونجر تهیه و سپس مهمترین مواد موثره اسانسی که بیشترین عملکرد آنتاگونیستی را داشتند توسط دستگاه GC/MS آنالیز گردید. همچنین فعالیت آنتاگونیستی باکتری‌های جداسازی شده از اپی‎فیت پرتقال شامل sp. Bacillus، Pseudomonassp.، Streptomycess sp. علیه قارچ پنی سیلیوم در قالب طرح فاکتوریل مورد بررسی قرار گرفت. بیشترین درصد ممانعت کنندگی (95/99 درصد)، توسط اسانس آویشن علیه پنی سیلیوم در غلظت 400 پی‎پی‎ام مشاهده گردید. آنالیز رگرسیونی تاثیر اسانس‌ها نشان داد با افزایش غلظت اسانس درصد بازدارندگی آن روی قارچ افزایش می‌یابد. بر اساس نتایج به دست آمده، اسانس آویشن با داشتن مهمترین ترکیبات موثره در اسانس‌ها (کارواکرول - 5/45 درصد)، آلفا- ترپینئول (-9/22 درصد) و اندو- بورنئول (3/14 درصد) بیشترین فعالیت ممانعت کنندگی (3/22 میلی‌متر) را علیه پنی سیلیوم از خود نشان داد. در بین 23 جدایه باکتریایی، یک جدایه به نام H7 بیشترین فعالیت ممانعت کنندگی را علیه قارچ داشت. با استفاده از PCR و تعیین توالی DNA ژنوم 16S rRNA، H7 به‌عنوان Bacillus cereus شناسایی گردید. بنابراین اسانس آویشن و جدایه (Bacillus cereus (H7 جایگزین‌های مناسبی برای کنترل شیمیایی پوسیدگی بعد از برداشت پرتقال می باشند.

 

واژه‌های کلیدی: آوریشن، اسانس، باکتری‌های آنتاگونیست، کارواکرول، کپک سبز مرکبات، Bacillus cereuse،Penicillium digitatum   [1]

 


 


مقدمه

مرکبات گروهی از میوه‌های نیمه گرمسیری جهان بوده که دارای ارزش اقتصادی بسـیار زیادی در کشـورهایی مانند برزیل، آمریکا و چین می‌باشند. امـروزه در دنیـا مجموع فعالیت‌های کشاورزی و اقتصادی و صنعتی ایـن گـروه تحت عنوان صنعت مرکبات شناخته می‌شود (Bousbia et al., 2009). از مهم‌ترین بیماری بعد برداشت مرکبات کپک‌های سبز و آبی مرکبات می‌باشد که به‌ترتیب توسط قارچ‌های Penicillium digitatum و P.italicum ایجاد می‌گردند (Valero and Serrano, 2010).

کپک سبز مرکبات که به‌وسیله P.digitatum ایجاد می‌گردد سبب بیش از 90 درصد خسارت در طول مراحل انبارداری و حمل‌ونقل در مرکبات می‌شود .میزان خسارت بیماری کپک سبز در شمال کشور 10 تا 15 درصد و در جنوب 2 تا 5 درصد گزارش شده است (Zamani et al., 2009). معمولا جهت کنترل کپک سبز مرکبات از سموم شیمیایی متداول ایمازالیـل، تیابندازول و ترکیبات گوگردی آلی و معدنی و مواد اکسیدکننده استفاده می‌گردد (Swamy and Sinniah, 2015).

به‌کارگیری روش‌های متفاوت برای مقاوم نگه‌داشتن میوه‌ها در مقابل پوسیدگی‌های بعد از برداشت مانند استفاده از هورمون‌ها، هوای سرد اگرچه تا حدی این پوسیدگی‌ها را کنترل می‌کنند ولی به‌صورت کامل مانع ایجاد پوسیدگی نمی‌شوند. بنابراین نیاز به کاربرد سموم شیمیایی جهت کنترل بهتر آلودگی قارچ همچنان وجود دارد و متاسفانه تکرار در استفاده از سموم شیمیایی سبب ایجاد مقاومت به گونه‌های P. digitatum وP. italicumمی‌گردد (Kinay et al., 2007). تاکنون تلاش‌های ابتدایی مختلفی برای کنترل بیماری‌ها بعد از برداشت انجام شده است که عبارتند از: شامل استفاده از Bacillus subtilisو Pseudomonas cepacia بوده است همه این آنتاگونیست‌ها می‌توانند محل زخم‌ها را کلونیزه کنند و مواد آنتی بیوتیک ترشح می‌کند نموده که و از گسترش پوسیدگی جلوگیری نمایند (Sharma et al., 2009).

تعدادی از محققان تأثیر مثبت باکتری Pseudomonas syringae در کنترل بیماری پوسیدگی بعد از برداشت مرکبات با تولید دو نوع فیتوتوکسین و همچنین تاثیر این دو فیتوتوکسین بر روی غشای سلول میزبان را گزارش نمودند. همچنین و توسط PCR ژن موثر در کنترل را ردیابی نمودند (Cirvilleri et al., 2005).

در سال‌های اخیر تحقیقات گسترده‌ای آغازگردیده که نشان می‌دهد متابولیت‌های ثانویه برخی گیاهان دارویی در جلوگیری از رشد قارچ‌ها مؤثر بوده و جایگزین مناسبی برای سموم شیمیایی هستند. تحقیقات نشان داده است که گیاهان معطر متعلق به تیره‌های نعناعیان، کاسنی و چتریان از ترکیبات ضد میکروبی و آنتی‌اکسیدانی برخوردار هستند. تعدادی از محققان تاثیر اسانس گیاهان دارویی آویشن (Thymus vulgaris)، آلوئه ورا (Aloe vera) و درخت چریش (Azadirichta indica) توانایی بازدارندگی از رشد میسلیومی و تولید اسپور توسط قارچ‌های بیمارگر Aspergilius niger، P.expansum وRhizopus stolonifer، اسانس گیاهان دارویی آویشن، مرزه، آلوئه ورا و درخت چریش را گزارش نمودند (Charles et al., 2012).

تاثیر ضد قارچی گیاه سیر بر روی گونه‌های مختلف قارچ پنی سیلیوم گزارش گردیده است و در تحقیقات آزمایشگاهی تاثیر ممانعت رشدی آن بر روی قارچ پنی سیلیوم گزارش گردیده است (Bandalan and Lauzon, 2018). پذیرا در سال 1396 فعالیت ضدقـارچی اسـانس آویشـن بـاغی (Thymus vulgairis) بـر روی قـارچ‌های ساپروفیت Aspergillus niger، A. fumigatusوA. flavusگزارش نمود (پذیرا، 1396).

تاثیر ضدقارچی مریم گلیSalvia officinalis  و آوشن شیرازیThymus vulgaris  بر علیه فوزاریوم گندم Fusarium graminearum  توسط تعدادی از محققان گزارش گردید (Alexa et al., 2018).

به‌دلیل حساسیت‌هایی که در استفاده از ترکیبات شیمیایی مصنوعی وجود دارد (به خاطر تهدید سلامتی انسان و محیط‌زیست) و همچنین افزایش تقاضای محصولات ارگانیک (تولیدشده بدون استفاده از نهاده‌های شیمیایی) و نیز به دلیل ایجاد نژادهای جدید و مقاوم پاتوژن در برابر قارچ‌کش‌های مورداستفاده، امروزه تلاش می‌شود تا از برخی مواد و فرآورده‌های طبیعی و فاقد اثرات جانبی زیان‌آور نظیر مانند اسانس‌های گیاهی و آنتاگونیست‌های موجود در طبیعت به‌عنوان جایگزین قارچ‌کش‌های شیمیایی در کنترل و یا کاهش بیماری‌ها و ضایعات انباری محصولات باغی استفاده گردد. هدف از این تحقیق بررسی تاثیر اسانس‌های چهار گیاه دارویی آویشن شیرازی (Thymus vulgaris)، آلوورا (Aloe vera)، سیر (Allium sativum) و زیره سبز (Cuminum cyminum) جمع‌آوری شده از منطقه قرق استان گلستان و باکتری‌های آنتاگونیست جداسازی شده از اپی فیت پرتقال بر روی ایجاد ممانعت رشدی در عامل بیماری کپک سبز پرتقال P.digitatum می‌باشد.

 

مواد و روش‌ها

جمع‌آوری، و جداسازی و خالص‌سازی قارچ عامل کپک سبز مرکبات: میوه‌های پرتقال رقم تامسون ناول که علائم کپک سبز مرکبات را به‌وضوح نشان می‌دادند از چند میوه‌ فروشی محلی جمع‌آوری شد و قطعات حاوی بافت سالم و آلوده از محل لکه‌ها نرم و لهیده شده میوه که حاوی میسلیوم‌های سفیدرنگ واسپورهای به رنگ سبز زیتونی قارچ عامل بیماری بود جداسازی و سپس خالص سازی شد و به روش نوک هیف و تک اسپور روی محیط کشت PDA کشت صورت گرفت (Timmer et al., 2000). با مقایسه استفاده از کلید شناسایی و مقایسه با استاندارد، قارچ Penicillium digitatum شناسایی و جداسازی گردید و ایزوله لازم از آن تهیه و بر روی محیط کشت (Potato Dextrose Agar) PDA کشت و نگهداری گردید.

تهیه سوسپانسیون قارچ: به پلیت ظرف حاوی محیط کشت 7 الی 9 روز قارچ، آب مقطر استریل به همراه یک قطره روغن تویین 20 اضافه شد و سپس با استفاده از لام گلبول شمار سوسپانسیون اسپور قارچ Penicillium digitatum با تعداد 104 اسپورتهیه گردید. برای مایه‌زنی مقدار 10 میلی‌لیتر از سوسپانسیون در داخل هر زخم ایجاد شده بر روی پوست پرتقال‌ها تزریق گردید (Timmer et al., 2000).

تهیه اسانس گیاهان دارویی: چهار گیاه دارویی آویشن شیرازی (Thymus vulgaris)، آلوورا (Aloe vera)، زیره سبز (Cuminum cyminum) و سیر (Allium sativum) از منطقه قرق استان گلستان تهیه گردید و در هربـاریوم دانشـگاه آزاد اسـلامی مـورد تاییـد قـرار گرفتنـد. برگ گیاهان دارویی آویشن، و میوه زیره سبز و حبه سیر توسط دستگاه خردکن هرکدام را کامل خرد شدند نموده و از گیاه آلوورا ژل داخل برگ‌ها استخراج شد و سپس در داخل شیشه‌های تیره‌رنگ در داخل یخچال نگهداری شد.

اسانس آن‌ها با استفاده از دستگاه کلونجر و به روش تقطیر با آب تهیه گردید، بدین‌منظور 100 گرم از ماده بافت خشک خرد شده گیاهی را داخل ارلن ریخته و دوسوم آن را آب مقطر استریل ریخته و به مدت سه ساعت عصاره گیری انجام شد و سپس دستگاه خاموش و اسانس در محل مدرج دستگاه جمع‌آوری شد ازآنجایی‌که اسانس سبک تراز آب است بنابراین روی آب قرار می‌گیرد سپس شیر خروج آب را بازنموده ابتدا آب و در ادامه مقداری اسانس با آب خارج شد راندمان اسانس‌گیری 6/0 درصد وزن گیاه بود (Bakkali et al., 2008).

تأثیر اسانس‌ها بر روی رشد عامل بیماری کپک سبز مرکبات: برای این منظور از روش اختلاط اسانس با محیط کشت PDA استفاده گردید و غلظت‌های ppm100، 200، 300، 400 اسانس در لیتر محیط کشت تهیه اضافه گردید و دیسک‌هایی از قارچ به قطر 5 میلی متردر وسط محیط‌های کشت حاوی غلظت‌های متفـاوت قرداده شد و پتری‌ها در دمای 25 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور نگهداری گردید شدند و پس از 24 ساعت، رشد رویشی‌هاله قارچ به‌طور روزانه اندازه‌گیری شد تا هنگامی که پتری شاهد توسط قارچ پنی سیلیوم به صورت کامل اشغال شود. این آزمایش با چهار بار تکرار انجام شد. محیط کشت حاوی محلول توئین 80 (05/0 درصد) به‌عنوان شاهد در نظر گرفته شد و درصد بازدارندگی رشد از فرمول زیر محاسبه شد (Udo et al., 2001).

100 × 100 قطر کلنی شاهد / (قطر کلنی تیمارها- قطر کلنی شاهد): درصد بازدارندگی رشد

تجزیه اسانس با دستگاه (GC/MS) برای شناسایی ترکیبات مؤثرترین ترکیبات اسانس در بازدارندگی از رشد قارچ: از دستگاه کروماتوگرافی گازی متصل به طیف نگار جرمی (GC/MS) برای بررسی اجزای تشکیل‌دهنده اسانس گیاهی دارای بیشترین ممانعت رشدی  استفاده شد.اسانس موردنظر به دستگاه تزریق و اجزای تشکیل دهنده اسانس تعیین گردید. طیف‌سنجی جرمی دستگاهی است که مولکول‌های گازی باردار را بر اساس جرم آن‌ها دسته‌بندی می‌کند و برحسب جرم آن‌ها را از یکدیگر جداسازی و ضمن شناسایی مقدار آن‌ها را در محلول اندازه‌گیری می‌کند. دستگاه گروماتوگراف گازی متصل به طیف‌سنج جرمی از نوع VARIAN مدل GC:CP-3800 با طیف‌سنج جرمی Saturn 2200 است.

جداسازی باکتری‌ها از پوست پرتقال: از پرتقال‌های تامسون ناول تهیه‌شده سالم که فاقد هرگونه زخم و عارضه بیولوژیک بوده و قبل از هرگونه اعمال شیمیایی به تعداد 4 عدد به‌صورت تصادفی انتخاب نموده و سپس پوست پرتقال را به قطعات کوچک، یک تا دو سانتی‌متری برش داده شد. مقدار 25 گرم از آن‌ها را در یک فلاسک نیم لیتری حاوی 225 میلی‌لیتر آب مقطر استریل و 50 میکرولیتر توئین 20 به‌مدت یک ساعت در شیکر دورانی قرار داده شد. سوسپانسیون‌های حاصله بر روی محیط کشت (Nutrient Agar) NA به‌صورت سفره‌ای کشت گردید و در دمای 25 درجه سانتی‌گراد در انکوباتور نگهداری گردید. پس از 24 و 48 ساعت کلنی‌های میکروارگانیسم‌های رشد کرده روی محیط کشت مذکور بر اساس مرفولوژی و رنگ جداسازی شده و در محیط کشت جدید تجدید کشت شدند. خالص سازی ایزوله‌های باکتریایی رشد نموده در محیط کشت از روش مخطط صورت گرفت (Brenner-Don et al., 2005). سپس ایزوله‌های جداسازی شده را در شرایط آزمایشگاهی مورد بررسی قرار داده و ایزوله‌های دارای پتانسیل آنتاگونیستی، را پس از مشاهده‌هاله ممانعت رشدی قارچ پاتوژن شناسایی و جداسازی و شناسایی گردید.

شناسایی جدایه‌های باکتری: در مواردی که جدایه‌ها دارای حالت آنتاگونیستی نسبت به عامل کپک سبز مرکبات Penicillium digitatum بودند پس از 48 تا 72 ساعت اطراف آن‌ها یک‌هاله شفاف که نشانه عدم رشد پاتوژن است دیده شد. به‌این‌ترتیب جدایه‌های آنتاگونیست از بقیه مجزا شدند. با استفاده از آزمون‌های میکروسکوپی، میکروسکوپی، واکنش گرم، و بررسی تحرک و آزمون‌های بیوشیمیایی شامل کاتالاز، ایندول، H2S، مصرف سیترات، هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز، کازئین و ذوب ژلاتین و نیز اکسیداسیون و تخمیر قند (O/F) جهت تشخصی گونه باکتری آنتاگونیست انجام گرفت. در نهایت، مؤثرترین باکتری در ایجاد ممانعت رشدی با روش مولکولی و از طریق تکثیر قطعه ژنی  SrRNA16 و تعیین توالی آن‌ها شناسایی دقیق شدند (John et al., 1997)

استخراج DNA و تکثیر قطعه ژنی SrRNA 16با استفاده از PCR: استخراج DNA ژنومی ایزوله‌های موثر با استفاده از کیت، Extraction kit Cat.No.DN8115C شرکت سیناژن ایران انجام شد. در پایان 60 میکرولیتر از محلول رویی حاوی DNA  بدست آمده در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد تا برای انجام PCR مورد استفاده قرار گیرد. پرایمرهای مورد استفاده در انجام آزمایش برای شناسایی مولکولی موثرترین باکتری با خاصیت آنتاگونیستی از پرایمر‌های یونیورسال:

 Forward (27F) با توالی:

5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' و

Reverse (1390R) با توالی:

5'-GACGGGCGGTGTGTACAA-3' استفاده گردید.

واکنش PCR با حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل: (5/2 میکرولیتر بافر 10X و 50 میلی‌مول MgCl2 ، 5/0 میکرولیتر dNTPs، 3/0 میکرولیتر ازTaq DNA Polymerase، یک میکرولیتر از هر آغازگر، دو میکرولیتر از نمونه DNA و 7/16 میکرولیتر آب مقطر دی یونیزه) انجام گرفت. واکنش PCR با شرایط دمایی واسرشت شدن ابتدایی در دمای 95 درجه سلیسیوس به مدت 5 دقیقه و در ادامه 30 چرخه شامل واسرشت در دمای 95 درجه سیلیسیوس به مدت 30 ثانیه، اتصال در دمای 95 درجه سیلسیوس به‌مدت 30 ثانیه، اتصال در دمای 56 درجه سیلیسیوس به‌مدت30 ثانیه، طویل شدن در دمای 72 درجه سیلسیوس به‌مدت 90 ثانیه و طویل شدن نهایی در دمای 72 درجه سیلیسیوس به‌مدت 10 دقیقه انجام شد. محصول PCR با استفاده از الکتروفورز در ژل آگاروز 8/0 درصد بررسی گردید. به‌منظور تایید شناسایی باکتری‌ها، توالی‌های حاصله با استفاده از نرم‌افزار بلاست با سایر توالی‌های نوکلئوتیدی نظیر از قبل موجود در بانک اطلاعات ژنی تطبیق داده شدند (Joo et al., 2007).

بررسی تأثیر باکتری بر روی عامل بیماری کپک سبز مرکبات در شرایط آزمایشگاه: از روش کشت متقابل استفاده گردید.سوسپانسیون (CFU/ ml-1 109) ایزوله باکتریایی به‌صورت یک خط مستقیم در یک سمت پلیت ظرف حاوی PDA کشت داده شد و 24 ساعت در دمای 25 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس یک دیسک دایره‌ای به قطر 5 میلی‌متر از کلنی قارچ انتخاب و در فاصله 5 میلی‌متری از خط کشت باکتری قرار داده شد. پلیت ظرف‌ها در دمای 25 درجه سانتی‌گراد انکوبه و کاهش رشد میسیلیومی قارچ پنی سیلیوم در مقایسه با نمونه کنترل محاسبه گردید.

 

آنالیز داده‌ها

در این بررسی نتایج به‌دست آمده در قالب طرح فاکتوریل و با استفاده از نرم‌افزار SAS وStatus Graphics از روش آماری General linear models استفاده شد صورت پذیرفت و مقایسه میانگین‌ها با آزمون LSD در رگرسیون ساده مورد تجزیه‌ و تحلیل آماری قرار گرفت.

 

نتایج

کلنی‌های ایزوله قارچ Penicillium digitatumسفید مایل به سبز تیره رنگ بوده کنیــدیفورها به‌صورت پایه‌هایی کشیده، ساده تا منشعب و شفاف می‌باشند و روی انشعابات کنیدیفور لایه‌ای از فیالید قـرار دارد. کنیـدیوم‌ها کم‌وبیش بیضوی تا استوانه‌ای شکل، تک‌سلولی و شفاف بودند.

نتایج در محیط کشت PDA بعد از هفت روز در شرایط آزمایشگاه بیانگر آن بود که بین تاثیر کلیه اسانس‌های گیاهان مورد استفاده در ایجاد درصد بازدارندگی در قارچ عامل کپک سبز P.digitatum در سطح 01/0 اختلاف معنی‌داری وجود داشته است. جدول آنالیز واریانس تأثیر اسانس‌ها در ایجاد درصد ممانعت رشدی بیانگر آن است که تیمارها در سطح (P=0.01) دارای اختلاف معنی داری می‌باشند (جدول 1). اسانس گیاه دارویی آویشن شیراز Thymus vulgaris بیشترین تأثیر ممانعت رشدی را بر روی قارچ پنی سیلیوم ایجاد نمود و با افزایش غلظت اسانس‌ها در محیط کشت درصد ایجاد ممانعت رشدی آن‌ها افزایش یافت. بین غلظت‌های متفاوت آویشن شیراز در ایجاد ممانعت رشدی از قارچ پنی سیلیوم در سطح 05/0 اختلاف معنی‌داری وجود داشت و اسانس آویشن در دو غلظت 300 و 400 پی‌پی‌ام قادر بود به‌ترتیب 5/98 و 9/99 درصد ممانعت رشدی ایجاد نماید. در غلظت 400 پی‌پی‌ام بین اسانس آویشن و آلوورا اختلاف معنی‌داری وجود نداشت و زیره سبز کمترین درصد بازدارندگی رشد را نشان داد در حالی که در غلظت‌های 100، 200، 300 پی‎پی‎ام بین آویشن و آلوورا در درصد بازدارندگی از رشد قارچ P. digitatum اختلاف معنی‌داری وجود داشت و تاثیر اسانس آویشن از آلوورا بیشتر بود. به عبارتی بین نوع اسانس و دوز مصرفی آن اثر متقابل معنی دار وجود داشت و با توجه به اینکه ازنظر درصد بازدارندگی غلظت‌های متفاوت روند افزایشی داشتند برای بررسی دقیق این روند، رگراسیون انجام داده شد.

بررسی رگرسیونی رابطه بین غلظت و درصد بازدارندگی اسانس گیاهان، روند افزایش درصد بازدارندگی قارچ  P. digitatum نشان داد با افزایش غلظت اسانس‌های گیاهان آویشن، آلوورا، سیر و زیره سبز در نمودارهای 1 و2 قابل مشاهده می باشد و اسانس حاصل از سه گیاه آلوورا، سیر و زیره سبز روند افزایش خطی داشتند در حالی که روند افزایشی گیاه دارویی آویشن به‌صورت منحنی بود به عبارتی در بررسی تاثیر گیاه دارویی آویشن تا غلطت 300 پی‎پی‎ام افزایش درصد بازدارندگی با شیب تندی با افزایش غلظت اسانس افزایش یافت و بعد از غلظت 300 پی‎پی‎ام شیب افزایش با سرعت کمتری صورت پذیرفت. در نمودا رگرسیون مشخص گردید که اسانس‌های آلوورا و سیر شیب افزایشی یکسانی داشته و با سرعت یکسانی با افزایش غلظت اسانس درصد بازدارندگی افزایش یافتند در حالی که اسانس زیره شیب تغییرات بیشتری داشته است و به ازای افزایش هر واحد غلظت اسانس تغییرات زیادی در درصد بازدارندگی رشد قارچ پنی سیلیوم ایجاد گردید.

طی آزمایشات صورت گرفته مشخص گردید اسانس آویشن شیرازی، موثرترین اسانس در ایجاد ممانعت رشدی قارچ پنی سیلیوم می‌باشد و پس از آب‌گیری توسط دستگاه GC/MS آنالیز گردید (جدول 2). حدود 17 ترکیب متفاوت شناسایی و جداسازی شد که بیشترین درصد مربوط به کارواکرول 5/45 درصد بود. پس‌ازآن به‌ترتیب و آلفا ترپینئول 9/22درصد و اندو بورنئول 3/14 درصد بیشترین درصد ترکیبات را داشتند. ترکیبات فوق از ترکیبات شناخته‌شده در اسانس گیاه دارویی آویشن با خاصیت ضد قارچی می‌باشند. در نمودار کروماتوگرام اسانس آویشن مشخص گردید پیک اول ترکیب اندوبورنئول (3/14درصد)، پیک دوم ترکیب آلفا ترپنئول (9/22 درصد)، پیک سوم ترکیب کارواکرول (5/45 درصد) نشان داده شد (شکل 3) در این تحقیق نشان داده شد که این ترکیبات مؤثرترین ترکیبات برای کنترل بیماری کپک سبز مرکبات نیز می‌باشند.

حدود 23 ایزوله باکتریایی از پوست پرتقال جدا گردید که از بین آن‌ها مهم‌ترین ایزوله‌هایی که دارای خاصیت آنتاگونیستی بودند مورد بررسی قرار گرفتند. ایزوله‌های مربوطه پس از انجام آزمون‌های بیوشیمیایی شناسایی شدند و مشخص شد که مربوط به سه
جنس Pseudomonas،Bacillus  و Stereptomycesمی‌باشند. از 5 ایزوله استرپتومایسس 3 ایزوله (H6, H16, H10)، از 6 ایزوله باسیلوس 4 ایزوله (H2, H7, H11, H1) و از 6 ایزوله سودوموناس 3 ایزوله (H3, H7, H8) واجد خاصیت آنتاگونیستی بودند.

بررسی ایزوله‌های دارای خاصیت آنتاگونیستی در شرایط آزمایشگاه بر روی قارچ پنی سیلیوم نشان دارد از بین سه ایزوله Streptomyces، ایزوله Streptomyces sp. H16 بیشترین خاصیت آنتاگونیستی را داشته و نسبت به دو ایزوله دیگر منطقه ممانعت رشدی باندازه 3/22 میلی‌متر ایجاد نموده است و این ایزوله جهت مقایسه با سایر باکتری‌ها مدنظر قرار گرفت و از بین 4 ایزوله دارای خاطیت آنتاگونیستی Bacillus ایزوله H7 با بیشترین توان ممانعت رشدی، منطقه ممانعت رشدی به اندازه 24 میلی‌متر ایجاد نمود. از بین 4 ایزوله Pseudomonas موثرترین ایزوله H3 باندازه 3/19 میلی‌متر منطقه ممانعت رشدی بود. مقایسه بین موثرترین ایزوله‌های سه باکتری Streptomyces sp. H16 و Pseudomonas sp. H3 و Bacillus sp. H7 در ایجاد ممانعت رشدی روی قارچ P. digitatum عامل کپک سبز مرکبات از لحاظ آماری اختلاف معنی‌داری را نشان داد (جدول 3) و بیشترین ممانعت رشدی توسط Bacillus sp. H7 صورت گرفت و جهت شناسایی تحت آنالیز مولکولی قرار گرفت.

شناسایی دقیق ایزوله Bacillus sp. H7 در سطح جنس و گونه با ردیف‌ سازی توالی‌های به‌دست آمده با توالی‌های موجود در بانک ژنی NCBI انجام شد. بلاست توالی 16SRNA ایزوله Bacillus sp. H7 با توالی‌های ثبت ‌شده در بانک ژنی NCBI بیانگر میزان 96 درصد شباهت ایزوله منتخب با باکتریBacilluscereus بود. توسط PCR قطعه DNA مورد انتظار به‌طول 1500 جفت باز برای توالی ژنتیکی جدابه مورد نظر تکثیر گردید (شکل 4).

 

بحث

در این تحقیق مشخص گردید گیاه دارویی آویشن در غلظت ppm400 قادر است 99/95 درصد در شرایط آزمایشگاه و 100 درصد روی میوه بازدارندگی در رشد قارچ P.digitatumایجاد نماید (جدول 1). گزارشات متعددی مبنی بر خاصیت ضدقارچی اسانس گیاهان دارویی متفاوت و همچنین گزارش نمودند افزایش درصد بازدارندگی گیاهان دارویی