فیتوسنتز نانوذرات نقره پایدار با استفاده از عصاره آبی گونه Salvia rhytidea Benth. و مقایسه عملکرد ضدمیکروبی آن با عصاره طبیعی گیاه

نوع مقاله: مقاله پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه سیستان و بلوچستان، دانشکده علوم پایه، گروه شیمی

2 عضو هیات علمی گروه شیمی، دانشگده علوم پایه، دانشگاه سیستان و بلوچستان

3 دانشجوی دکتری شیمی تجزیه، دانشکده علوم پایه، گروه شیمی، دانشگاه آزاداسلامی، واحد کرمان، کرمان، ایران

چکیده

مطالعه حاضر اولین گزارش از فیتوسنتز نانوذرات نقره از عصاره­آبی ریشه گیاه­دارویی مریم­گلی­تفتانی (Salvia rhytidea Benth.) و مقایسه عملکرد ضدمیکروبی آن با عصاره طبیعی گیاه می­باشد. نمونه‌های گیاهی در مرحله گلدهی در خردادماه سال 1396 از ارتفاعات کوه تفتان (طول 60 درجه و 44 دقیقه شرقی و عرض 28 درجه و 33 دقیقه شمالی و در ارتفاع   1394 متر بالاتر از سطح دریا) جمع‌آوری شدند. پس از تهیه عصاره به روش خیساندن، نانوذرات نقره به روش زیستی سنتز شدند. سپس پارامترهایی همچون pH واکنش، غلظت نیترات نقره و زمان واکنش مورد مطالعه قرار گرفته و بهینه سازی شدند. پس از بررسی خصوصیات نانوذرات توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره و پراش پرتو ایکس، خاصیت ضدمیکروبی آن­ها علیه باکتری­های سالمونلا­تیفی موریوم، اشرشیاکلی، باسیلوس­سرئوس و استافیلوکوکوس­اورئوس و قارچ­های آسپرژیلوس­فلاووس و پنی سیلیوم‌اکسپانسوم به دو روش انتشار از دیسک و حداقل غلظت مهار­کننده رشد بررسی شد و با فعالیت ضدمیکروبی عصاره­آبی مقایسه شد. نانوذرات به دست آمده دارای ماکسیمم جذب در طول­موج 415-400 نانومتر، اندازه میانگین 20-25 نانومتر، شکل کروی و یکنواخت بودند. بررسی فعالیت ضدمیکروبی نشان­داد که اثرات ضدمیکروبی وابسته به غلظت بوده و در غلظت­های یکسان، نانوذرات دارای اثر مهارکنندگی به مراتب بیشتری در مقایسه با عصاره­آبی بوده­اند، به گونه­ای که در غلظت 50 میکروگرم­ بر میلی­لیتر، بیشترین اثر مهارکنندگی علیه باکتری استافیلوکوکوس­اورئوس (19 میلی­متر) و قارچ آسپرژیلوس­فلاووس (19 میلی­متر) مشاهده شد. بر اساس نتایج به دست آمده گیاهان دارای پتانسیل بالایی جهت سنتز زیستی نانوذرات بوده که به عنوان میکروب زدا می توانند در صنایع گوناگون مورد استفاده قرار گیرند.

کلیدواژه‌ها


 

 

فصلنامه اکوفیتوشیمی گیاهان دارویی، شماره پیاپی 30، سال هشتم، شماره 2، تابستان 1399

 


فیتوسنتز نانوذرات نقره پایدار با استفاده از عصاره آبی گونه

 Salvia rhytidea Benth.و مقایسه عملکرد ضدمیکروبی آن با عصاره طبیعی گیاه

 

امید عزیزیان شرمه1، ابراهیم ملاشاهی2*، مژگان طاهری‌زاده3

1دانشجوی دکتری ، گروه شیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه سیستان و بلوچستان، زاهدان، ایران

2استادیار، گروه شیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه سیستان و بلوچستان، زاهدان، ایران

3دانشجوی دکتری، گروه شیمی، دانشکده علوم پایه، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرمان، کرمان، ایران

 

تاریخ دریافت: 6/11/98            تاریخ پذیرش: 12/5/99

 

چکیده

            مطالعه حاضر اولین گزارش از فیتوسنتز نانوذرات نقره از عصاره­آبی ریشه گیاه­دارویی مریم­گلی­تفتانی (Salvia rhytidea Benth.) و مقایسه عملکرد ضدمیکروبی آن با عصاره طبیعی گیاه می­باشد. نمونه‌های گیاهی در مرحله گلدهی در خردادماه سال 1396 از ارتفاعات کوه تفتان (طول 60 درجه و 44 دقیقه شرقی و عرض 28 درجه و 33 دقیقه شمالی و در ارتفاع   1394 متر بالاتر از سطح دریا) جمع‌آوری شدند. پس از تهیه عصاره به روش خیساندن، نانوذرات نقره به روش زیستی سنتز شدند. سپس پارامترهایی همچون pH واکنش، غلظت نیترات نقره و زمان واکنش مورد مطالعه قرار گرفته و بهینه سازی شدند. پس از بررسی خصوصیات نانوذرات توسط میکروسکوپ الکترونی گذاره و پراش پرتو ایکس، خاصیت ضدمیکروبی آن­ها علیه باکتری­های سالمونلا­تیفی موریوم، اشرشیاکلی، باسیلوس­سرئوس و استافیلوکوکوس­اورئوس و قارچ­های آسپرژیلوس­فلاووس و پنی سیلیوم‌اکسپانسوم به دو روش انتشار از دیسک و حداقل غلظت مهار­کننده رشد بررسی شد و با فعالیت ضدمیکروبی عصاره­آبی مقایسه شد. نانوذرات به دست آمده دارای ماکسیمم جذب در طول­موج 415-400 نانومتر، اندازه میانگین 20-25 نانومتر، شکل کروی و یکنواخت بودند. بررسی فعالیت ضدمیکروبی نشان­داد که اثرات ضدمیکروبی وابسته به غلظت بوده و در غلظت­های یکسان، نانوذرات دارای اثر مهارکنندگی به مراتب بیشتری در مقایسه با عصاره­آبی بوده­اند، به گونه­ای که در غلظت 50 میکروگرم­ بر میلی­لیتر، بیشترین اثر مهارکنندگی علیه باکتری استافیلوکوکوس­اورئوس (19 میلی­متر) و قارچ آسپرژیلوس­فلاووس (19 میلی­متر) مشاهده شد. بر اساس نتایج به دست آمده گیاهان دارای پتانسیل بالایی جهت سنتز زیستی نانوذرات بوده که به عنوان میکروب زدا می توانند در صنایع گوناگون مورد استفاده قرار گیرند.

 

واژه‌های کلیدی:فعالیت ضدمیکروبی، فیتوسنتز، گیاه مریم گلی تفتانی، نانوذرات نقره[1]

 

 


 


مقدمه

            با توجه به استفاده­ی بی رویه از آنتی بیوتیک­ها و افزایش مقاومت در باکتری­ها، یافتن جایگزین­های مناسب برای آنتی‌بیوتیک­ها امری ضروری می­باشد. به‌همین دلیل مطالعات گسترده­ای در مورد پتانسیل استفاده از ترکیبات ضدمیکروبی با منشا گیاهی و نیز استفاده از نانوذرات برای کنترل و درمان عوامل بیماری­زا صورت گرفته است (Kaushik Thakkar et al., 2010; Wang et al., 2017; Singh et al., 2018; Vallet-Regi et al., 2019). فناوری نانو اصطلاحاً به طراحی، بررسی خصوصیات، تولید و استفاده از ساختارها و ابزارها با کنترل شکل و اندازه در مقیاس نانومتریک (100-1 نانومتر) اطلاق می­شود (Govindaraju et al., 2010). به‌طورکلی روش­های شیمیایی، فیزیکی و زیستی را می­توان روش­های متداول تولید نانوذرات نام برد (Mohasseli and Pourseyyedi, 2015). تولید نانوذرات با روش­های فیزیکی و شیمیایی علاوه بر پرهزینه بودن، آلودگی‌های زیست محیطی را به همراه دارد و دارای عوارض جانبی متفاوتی خواهند بود. در سال‌های اخیر استفاده از روش­های زیستی مانند استفاده از گیاهان بدلیل ساده بودن، کم هزینه بودن، داشتن راندمان بالا، غیر سمی و سازگار با محیط زیست بودن، فراوان و قابل دسترس بودن، کامل بودن و کم بودن زمان واکنش، تولید نانوذرات با اشکال مختلف و یکنواخت بودن اندازه آن­ها، توجه ویژه ای را نسبت به سایر روش­ها به خود جلب کرده است (Wang et al., 2009; Ashiri and Safari, 2013). در میان نانومواد و نانوذرات، نانوذرات نقره به دلیل ویژگی وابسته به اندازشان توجه ویژه­ای را به خود جلب کرده­اند. یکی از مهمترین ویژگی این نانوذرات، فعالیت ضدمیکروبی بالای آن­ها می­باشد. نانوذرات نقره تولید شده با روش زیستی دارای ویژگی­های مفیدی مانند میزان سطح بالا، اندازه کوچک و پراکندگی بالا است که مجموعه این عوامل سبب شده تا اثرات ضد میکروبی نانوذرات نقره در مقایسه با یون نقره افزایش چشمگیری داشته باشد (Kaviya et al., 2011). از آنجایی که اندازه و شکل این نانوذرات بر کارایی اثر ضدمیکروبی آن­ها وابسته می­باشد، لذا فعالیت نانوذرات نقره تولید شده به روش زیستی بعلت کوچکتر­بودن و یکنواخت­بودن شکل و اندازه آن­ها، دارای اثر میکروب­کشی بیشتری خواهند بود. نانوذرات نقره تولید شده با روش زیستی دارای ویژگی­های مفیدی مانند میزان سطح بالا، اندازه کوچک و پراکندگی بالا است که مجموعه این عوامل سبب شده تا اثرات ضد میکروبی نانوذرات نقره در مقایسه با یون نقره افزایش چشمگیری داشته (Kaviya et al., 2011). با توجه به افزایش اثرات ضد میکروبی نقره در مقیاس نانو، می­توان از نانوذرات نقره برای مبارزه با عوامل بیماریزایی مختلف استفاده نمود بطوریکه امروزه با توسعه علم نانوتکنولوژی و تولید نانوذرات نقره، این نانوذرات کاربردهای فراوانی در علوم مختلف مانند پزشکی، داروسازی، آرایشی و بهداشتی و صنعت مواد غذایی پیدا کرده اند و استفاده از نقره و نانوذرات آن به عنوان ماده باکتری­کش قدرتمند، رونق یافته است (Chaloupka et al., 2010; Cho et al., 2005; Cao et al., 2002). یکی از صنایعی که تاکنون در استفاده از فناوری نانو پیش قدم بوده است، صنایع غذایی می­باشد. خواص ضد میکروبی نانوذرات نقره و استفاده مفید از آن در بیوتکنولوژی و مهار اختصاصی میکروب­ها در مطالعات مختلفی بررسی و به اثبات رسیده است، بطوریکه نانوذرات نقره می­توانند با مهار سیستم تنفسی باکتری­ها بر متابولیسم و نیز فرایندهای تولید مثل میکروارگانیسم­ها اثرگذار باشند و باعث ایجاد آسیب­هایی در غشای سلولی باکتری­ها گردند (Christian et al., 2008). اثر نانوذرات نقره بر روی باکتری­های گرم مثبت، گرم منفی، کپک‌ها و قارچ‌ها نیز به اثبات رسیده است. افزایش جمعیت و کمبود مواد غذایی، سبب شده است تا در چند دهه اخیر توجه خاصی به مواد غذایی و راه­های نگهداری آن­ها صورت گیرد. افزایش بیماری­های غذایی سبب مشکلات حاد اجتماعی و اقتصادی بسیاری شده­است (Salmanpour et al., 2016). تاکنون روش­های مختلفی برای افزایش ماندگاری محصولات و حفظ کیفیت آن­ها بکار گرفته شده است که یکی از این روش­ها، تغییراتی در سیستم بسته بندی مواد غذایی می­باشد. مطالعات گسترده ای بر روی اثر ضدمیکروبی و مهار کنندگی نانوذرات بویژه نانوذرات نقره بر پاتوژن‌های غذایی صورت گرفته است (Zarei et al., 2014). علیرغم استقبال گسترده از استفاده از نانوذرات نقره، قوانین اتحادیه­ی اروپا حد مجاز یون­های نقره در مواد غذایی را به
mg Ag/Kg 05/0 محدود کرده است (Fernandez et al., 2009). بسیاری از منابع غذایی خصوصاً منابع غذایی دامی، منبع تعداد زیادی از میکروارگانیسم‌ها هستند که برخی از آن­ها بصورت میکروارگانیسم­های بومی شناخته می­شوند که غیر بیماری­زا هستند و مابقی بعنوان میکروارگانسم­های بیماری­زا هستند و موجب مسمومیت غذای می­شوند که به‌عنوان مثال می­توان به لیستریا، استافیلوکوکوس، سالمونلا، اشرشیا کلی، شیگلا و مانند آن اشاره کرد (Shekarforosh et al., 2013). تاکنون روش­های مختلفی مانند سردسازی محصول بلافاصله پس از صید (برای دام، طیور و آبزیان) (Ozogul et al., 2004)، بسته بندی در خلا و اتمسفر اصلاح شده (Ozyurt et al., 2009)، انجماد (Aubourg et al., 2005) استفاده از آنتی­اکسیدان­های طبیعی و مصنوعی (Banerjee, 2006)، روکش­دار کردن و بسته­بندی (Fan et al., 2009) در افزایش ماندگاری محصولات و حفظ کیفیت آن­ها بکار گرفته شده است که از بین این روش­ها، تغییرات در سیستم بسته بندی مواد غذایی بیشتر از سایرین مورد استفاده قرار می­گیرد. تاکنون مطالعات مختلفی بر روی اثر ضدمیکروبی نانوذرات نقره صورت گرفته است(Stobie et al., 2008; Monteiro et al., 2009). مطالعات نشان دادند که نانوذرات نقره بر ماندگاری بسیاری از میوه­ها تأثیر چشمگیری داشته است (Chung et al., 2010; Ding et al., 1998). گزارشات حاکی از آن است که استفاده از نانوذرات نقره در بستر نانوزیست کامپوزیت کیتوسان برای استفاده در بسته بندی مواد غذایی، موجب مهار بسیاری از میکروب­های بیماری­زا شده است (Ebrahimi asl and Zarei, 2015). نتایج بررسی­ها نشان داد که کاربرد بسته بندی با پوشش زئولیت نقره (متوسط قطر 50 نانومتر) منجر به ممانعت یا کاهش رشد باکتری Alicyclobaciluus cidoterrestris شده است (Zandi Navgaran et al., 2014). تحقیقات اخیر نشان می­دهد که روش آغشته سازی با نانوذرات نقره نسبت به روش پوشش دهی سطوح اثر آنتی میکروبی بیشتری را موجب می­شود (Furno et al., 2004). جنس Salviaمتعلق به تیره نعناعیان (Lamiaceae)، با بیش از 311 گونه در سراسر جهان به ویژه در منداطق گرمسیری و معتدل، رویشی وسیع دارد. بزرگترین منطقه رویش گونه‌های این جنس، آمریکا و جنوب غربی آسیاست (Walker & Sytsma, 2007). گیاه دارویی مریم گلی تفتانی (Salvia rhytidea Bent) از جمله گیاهان دارویی بومی استان سیستان و بلوچستان می­باشد  (Jassbi et al., 2017). مریم گلی گیاهی است چند ساله که دارای برگ‌های بلند و نیزه ای شکل است. سطح فوقانی و تحتانی برگ‌ها پوشیده از کرک‌های ظریفی می‌باشد. گل‌ها به رنگ بنفش متمایل به آبی، صورتی یا گاهی سفید و به صورت مجتمع در قسمت فوقانی ساقه‌ها، روی چرخه‌های مخصوصی مشاهده می شوند (Omidbaigi, 2005). از دیرباز گونه‌های مختلف جنس مریم گلی (Salvia) دارای استفاده‌های متعدد دارویی بوده که امروزه نیز از فراورده‌های مختلف از جمله اسانس آنها استفاده‌های زیادی بعنوان طعم‌دهنده، نگهدارنده و آنتی‌اکسیدانت در صنایع غذایی و داروسازی کاربرد دارد (Shafizadeh, 2002). مریم گلی گیاهی است ضدتشنج، تب بر، مسکن اعصاب و در تسکین دردهای گوارشی، مقوی حافظه، کم کننده فشار خون، قند خون و نیز در درمان بیماری میگرن و پارکینسون مورد استفاده قرار میگیرد (Amiri, 2007). در طب سنتی، برخی از گونه‌های مریم گلی برای درمان سرماخوردگی، آسم، اگزما، سل و بیماریهای پوستی استفاده شده‌اند (Salimpour, 2011). از همه اندام‌های این گیاه در طب سنتی و مدرن استفاده می‌شود، بطوریکه درمان بیش از 60 بیماری بوسیله این گیاه تایید شده است (Zarei & Morovati Sharifabadi, 2017). از آنجایی که تاکنون مطالعه ای بر روی سنتز نانوذرات توسط گیاه مریم گلی تفتانی صورت نگرفته است و با توجه به اهمیت استفاده از نانوذرات نقره در میکروب کشی و روش سبز سنتز این نانوذرات، مطالعه حاضر، به بررسی اثر ضدمیکروبی نانوذرات نقره بیوسنتز شده با منشأ گیاهی (عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی) بر روی برخی از باکتری­ها و قارچ‌ها شامل سالمونلا تیفی موریوم[2]، اشرشیاکلی[3]، باسیلوس سرئوس[4]، استافیلوکوکوس اورئوس[5]، آسپرژیلوس فلاووس[6] و پنی سیلیوم اکسپانسوم[7] می­پردازد.

 

مواد و روش‌ها

مواد شیمیایی و میکروارگانیسم‌ها: تمامی مواد شیمیایی مورد استفاده در این پژوهش، با بالاترین خلوص تهیه شدند. نمک نقره نیترات  از شرکت سیگما-آلدریچ، سدیم هیدروکسید و هیدرو کلریدریک اسید، از شرکت مرک و باکتری­های استفاده شده  استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس، اشرشیا کلی و سالمونلا تیفی موریوم و قارچ‌های استفاده شده آسپرژیلوس فلاووس و پنی سیلیوم اکسپانسوم از مرکز کلکسیون میکروارگانیسم­های صنعتی ایران[8] تهیه شدند و در حین آزمایش برای ساختن تمامی محلول­ها و شستشوها از آب دوبار تقطیر استفاده شد.

آماده سازی عصاره: نمونه­های تاره گیاهی شامل ریشه گیاه مریم گلی تفتانی در مرحله گلدهی در خردادماه سال 1396 از ارتفاعات کوه تفتان، توابع شهرستان خاش در استان سیستان و بلوچستان جمع آوری شد. این منطقه از نظر جغرافیایی در طول 60 درجه و 44 دقیقه شرقی و عرض 28 درجه و 33 دقیقه شمالی و در ارتفاع   1394 متر بالاتر از سطح دریا واقع شده است. پس از تهیه، خشک و پودر کردن نمونه گیاهی، عصاره گیری به روش خیساندن (ماسراسیون) انجام شد. بدین منظور، مقدار 1 گرم از پودر آن  با 100 میلی­لیتر از آب دوبار تقطیر، به مدت 30 دقیقه در دمای 50 درجه سانتی گراد به هم­زده و حرارت داده شد (Azizian-Shermeh et al., 2019 a). مخلوط حاصل پس از سرد شدن در دمای آزمایشگاه، توسط کاغذ صافی واتمن شماره 42 صاف و برای حذف کامل ذرات معلق در آن به مدت 30 دقیقه بوسیله دستگاه سانتریفیوژ با سرعت  rpm 10000 (دور در دقیقه) سانتریفیوژ شد. عصاره بدست آمده در دمای 4 درجه سانتی­گراد برای استفاده­های بعدی نگهداری شد.

سنتز اولیه نانوذرات نقره: ابتدا مقدار 2 میلی­لیتر از عصاره گیاه به 4 میلی­لیتر از محلول نمک نقره نیترات با غلظت 1 میلی­مولار اضافه شد و محصول حاصل جهت بررسی سنتز نانوذرات و اندازه آن­ها توسط اسپکتروفتومتری فرابنفش-مرئی در محدوده جذبی 200 تا 800 نانومتر و میکروسکوپ الکترونی عبوری گرفته و مورد مطالعه قرار گرفت (Azizian-Shermeh et al., 2017 a).

بررسی پارامترهای موثر بر سنتز نانوذرات نقره: بمنظور سنتز نانوذراتی با شکل و اندازه مناسب، پارامترهای موثر بر سنتز همچون pH واکنش، غلظت نمک نقره نیترات و زمان واکنش مورد مطالعه قرار گرفته و بهینه سازی شدند (Azizian-Shermeh et al., 2019 b). جهت بررسی و بهینه سازی مقدار pH، پنج سری محلول حاوی عصاره و محلول نمک نقره نیترات ساخته و پس از تنظیم pH (2، 4، 6، 8 و10)، طیف­های جذبی محلول­ها توسط اسپکتروفتومترفرابنفش- مرئی در محدوده جذبی 200 تا 800 نانومتر گرفته و pH بهینه انتخاب شد. برای تنظیم pH محلول از یکی از دو محلول NaOH و یا HCl با غلظت 1/0 مولار استفاده گردید. برای بررسی تأثیر غلظت یون نقره (I)، محلول‌هایی حاوی عصاره و غلظت­های متفاوت محلول نقره نیترات (1 تا 5) میلی­مولار افزوده و پس از تنظیم pH بهینه، از محلول­های ساخته شده طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش-مرئی گرفته و غلظت بهینه انتخاب شد. با تنظیم شرایط بیوسنتز نانوذرات نقره در پارامترهای بهینه شده شامل (pH واکنش و غلظت محلول نقره نیترات)، اثر زمان بر بیوسنتز نانوذرات نقره و میزان پایداری نانوذرات بدست آمده مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور، محلولی با اعمال تمامی شرایط بهینه شده قبل، از لحظه ساخته شدن نمونه تا 48 ساعت پس از آن آماده و از تمامی آن­ها طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش-مرئی گرفته و زمان بهینه انتخاب شد.

بررسی خصوصیات و ویژگی­های نانوذرات بیوسنتز شده: به منظور تأیید نتایج بدست آمده از طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش-مرئی و تعیین توزیع شکل و اندازه نانوذرات نقره سنتز شده با اعمال فاکتورهای موثر، توسط تکنیک­های پراش پرتو ایکس (X-ray diffraction) مدل Bruker-D8 advance و میکروسکوپ الکترونی عبوری (Transmission Electron Microscopy) مدل Zeiss-EM10C مورد بررسی قرار گرفت.

بررسی فعالیت ضدمیکروبی: نمونه­های میکروبی با استفاده از محیط کشت لوریا برتانی برای باکتری­ها و سابورد دکستروز برای قارچ­ها و بر اساس روش­های استاندارد احیاء گردیدند و به منظور سوسپانسیون میکروبی از کشت 24 ساعته هر میکروارگانیسم به صورت مجزا به لوله­های آزمایش حاوی 3 میلی­لیتر مولر هینتون براث تلقیح شد و سوسپانسیونی با کدورت معادل نیم مک فارلند آماده گردید.بررسی اثرات ضد باکتریایی و ضد قارچی عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی ابتدا با روش انتشار از چاهک در آگار (Agar Well Diffusion) انجام شد (Azizian-Shermeh et al., 2016 a). بدین منظور از سوسپانسیون هر میکروب به مقدار 100 میکرولیتر روی پلیت حاوی مولر هینتون آگار برای باکتری­ها و سابورد دکستروز آگار برای قارچ­ها ریخته و با سواپ استریل در سه جهت به صورت انبوه کشت داده شد. سپس در سطح هر یک از پلیت­های کشت داده شده چاهک­هایی به قطر تقریباً 6 میلی­متر و به فاصله 2 سانتی­متری از هم ایجاد گردید و درون هر چاهک مقدار 50 میکرولیتر از هر یک از رقت­های آماده شده عصاره آبی با سمپلر ریخته شد. از آنتی بیوتیک­های ضد باکتریایی آمپی سیلین و جنتامیسین و ضد قارچی کلوتریمازول به عنوان شاهد مثبت و از محلول DMSO به عنوان شاهد منفی استفاده گردید. پس از اتمام کار محیط­های کشت باکتریایی در انکوباتور 37 درجه به مدت 24 ساعت و کشت­های قارچی در انکوباتور 28 درجه به مدت 48 ساعت انکوبه گشت و در نهایت پس از گذشت 48-24 ساعت، کشت­های میکروبی از نظر تشکیل یا عدم تشکیل‌هاله عدم رشد مورد بررسی قرار گرفته و قطر‌هاله­های تشکیل شده بر حسب میلی­متر اندازه گیری و گزارش شد.برای تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) عصاره مورد نظر ، از روش رقت لوله­ای استفاده گردید (Azizian-Shermeh et al., 2016 a). بدین منظور از عصاره آبی آماده شده در لوله­های آزمایش حاوی 9 میلی­لیتر محیط کشت مولر هینتون براث سری رقت‌های 56/1، 125/3، 25/6، 5/12، 25، 50، 100 و 200 میکروگرم بر میلی­لیتر از عصاره تهیه شد. سپس به هر یک از لوله­ها 1 میلی­لیتر از سوسپانسیون میکروبی تهیه شده تلقیح گردید. یک لوله آزمایش حاوی محیط کشت و میکروب تلقیح شده ولی فاقد عصاره به عنوان شاهد مثبت و لوله آزمایش حاوی محیط کشت با رقت 25 میکرو­گرم بر میلی­لیتر عصاره ولی فاقد باکتری به عنوان شاهد منفی نیز آماده گردید و در نهایت تمامی لوله­های آزمایش به انکوباتور با دمای 37 درجه برای باکتری­ها و دمای 28 درجه برای قارچ­ها و به مدت 48-24 ساعت انتقال داده شدند. بعد از انکوباسیون، هر لوله از نظر کدورت حاصل از رشد میکروارگانیسم بررسی و کمترین رقتی که در آن به علت اثر مهارکنندگی عصاره کدورتی ایجاد نشده بود به عنوان MIC در نظر گرفته شد.

            برای بررسی اثرات ضدباکتریایی و ضدقارچی نانوذرات نقره سنتز شده نیز از روش­های انتشار چاهکی و تعیین MIC استفاده شد. سری رقت­های استفاده شده برای تعیین‌هاله عدم رشد در روش انتشار از چاهک 10، 20، 40، 50، 60 و 100 میکروگرم بر میلی­لیتر بود و محلول 50 میکروگرم بر میلی­لیتر نقره نیترات و آنتی بیوتیک ضد باکتریایی آمپی سیلین و جنتامیسین و آنتی بیوتیک ضد قارچی کلوتریمازول به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد.  برای تعیین MIC نیز برای هر باکتری و قارچ یک سری 10 لوله ای با رقت‌های 78/0، 56/1، 12/3، 25/6، 5/12، 25، 50، 100، 200 و 400 میکروگرم بر میلی لیتر از نانوذرات نقره استفاده گردید و به عنوان کنترل مثبت از لوله حاوی فقط محیط کشت همراه با میکروب تلقیح شده به کار گرفته شد و برای کنترل منفی و به منظور اطمینان از استریل بودن مراحل انجام کار و نیز سوسپانسیون نانوذرات نقره سنتز شده، درون یک لوله تنها محیط کشت و در لوله دیگری محیط کشت حاوی محلول با غلظت نیم میکروگرم بر میلی لیتر نانوذرات نقره اضافه گردید. سایر مراحل انجام کار همانند نحوه آماده سازی محیط‌های کشت، سویه­های میکروبی استفاده شده و روش انجام، مشابه روش‌های استفاده شده در آزمایش مربوط به عصاره آبی گیاه بوده است.

 

نتایج

            در سنتز اولیه نانوذرات نقره با استفاده از عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی، عصاره بعنوان عوامل کاهنده (احیاکننده) و پایدارکننده نقش بازی می­کند. شکل 1 طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش-مرئی و تغییر رنگ محلول حاوی نانوذرات نقره سنتز شده توسط عصاره بدون اعمال شرایط بهینه را نشان می­دهد. با توجه به شکل 1، در طول موج 415-400 نانومتر که مربوط به رزونانس پلاسمون سطحی نانوذرات نقره می­باشد، عصاره فاقد پیک بوده که این مشاهده بیانگر آن است که وجود پیک در طول موج مورد نظر، بدلیل سنتز موفق  و وجود نانوذرات نقره در محلول می­باشد و عصاره هیچ گونه تداخل و مزاحمتی در طیف حاصل از نانوذرات نقره ایجاد نکرده است.

 

 

شکل 1: طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش-مرئی نانوذرات نقره و عصاره آبی گیاه مریم گلی

تفتانی بدون اعمال شرایط بهینه

 

 

            در بررسی تأثیر pH، پس از اضافه کردن عصاره به نمک نقره نیترات، مشاهده شد که رنگ محلول به رنگ قهوه­ای متمایل شده است (شکل 1). که این رنگ دلیلی بر سنتز موفق این نانوذرات می­باشد. مقدار pH محلول بدست آمده توسط دستگاه pH متر، عدد 63/5 قرائت شد. به جهت بررسی اثر فاکتور pH بر روند سنتز نانوذرات، pH‌های بالاتر و کمتر از مقدار اولیه مورد مطالعه قرار گرفت و از تمامی نمونه­ها طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش-مرئی گرفته شد (شکل 2). نتایج نشان داد که در 2pH= تغییر محسوسی در جذب ملاحظه شده اما مقدار جذب نسبت به سایر pH‌ها کمتر بوده است. به طوری که می توان گفت، سنتز کمی در این pH انجام گرفته است. لیکن با افزایش تدریجی میزان pH محلول تا 8، جذب محلول بصورت چشمگیری افزایش یافته است که دلیلی بر افزایش در مقدار سنتز نانوذرات نقره است. در 8pH=، طیفی متقارن با بیشترین مقدار جذب نسبت به مابقی  pH‌ها، مشاهده شده است اما در pH بالاتر (10pH=) افت شدید و محسوسی در مقدار جذب ملاحظه شده است. در نتیجه مقدار 8pH= بعنوان pH بهینه و مناسب انتخاب شد.

 

 

شکل 2: طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش-مرئی نانوذرات نقره بیوسنتز شده در pH‌های متفاوت

 

            تأثیر مقدار غلطت یون فلزی بر روند سنتز نانوذرات توسط شکل 3 بخوبی نشان داده شده است. با توجه به شکل 3، ملاحظه شد که با افزایش تدریجی در میزان غلظت یون نقره، جذب مربوط به محلول حاوی نانوذرات نقره افزایش چشمگیری داشته است. این افزایش تا غلظت 4 میلی مولار از یون نقره (AgNO3) ادامه دارد اما در غلظت 5 میلی­مولار، نه تنها افزایش قابل ملاحظه­ای در مقدار جذب مربوط به نانوذرات دیده نشد بلکه حتی افت شدیدی در میزان جذب مشاهده شده است. در نتیجه مقدار غلظت 4 میلی­مولار از نمک نقره نیترات بعنوان غلظت بهینه و مناسب انتخاب شد.

 

 

 

شکل 3: طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش-مرئی نانوذرات نقره بیوسنتز شده در

غلظت‌های متفاوت نمک نقره نیترات

 

 

            نتایج بررسی تأثیر زمان مجاورت محلول نقره نیترات با عصاره آبی گیاه بر روند واکنش نشان می­دهند که با افزایش زمان برهمکنش میان واکنشگرها از لحظه اول، مقدار جذب افزایش می­یابد و این افزایش در جذب تا 12 ساعت ابتدایی، کاملاً صعودی و بصورت خط راست بوده است، اما از زمان 12 ساعت به بعد، تغییر محسوسی در مقدار این جذب مشاهده نشده است که این مشاهده، پایدار بودن نانوذرات حاصل را به اثبات می­رساند. در نتیجه، زمان 12 ساعت بعنوان زمان بهینه و مناسب انتخاب شد (شکل 4).

 

 

 

شکل 4: طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش-مرئی نانوذرات نقره بیوسنتز شده و حداکثر جذب آن‌ها در زمان‌های مختلف


بررسی تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری (TEM): توزیع شکل و اندازه نانوذرات نقره سنتز شده توسط تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری مورد مطالعه قرار گرفت. شکل 5 تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری نانوذرات نقره سنتز شده با اعمال تمامی شرایط بهینه شده را نشان می­دهد. تصویر نشان می­دهد که نانوذرات بدست آمده همگی تقریباً کروی بوده و اندازه متوسط آنها بین 25-20 نانومتر بوده است.

 

 

 

 

شکل 5: تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری نانوذرات نقره بیوسنتز شده توسط عصاره گیاه مریم گلی تفتانی

 


بررسی طیف پراش پرتو ایکس (XRD): برای بررسی بیشتر و مطالعه­ی ساختار بلوری نانوذرات نقره سنتز شده، از آنالیز پراش پرتو ایکس استفاده شد (شکل 6). میانگین اندازه دانه‌های بلوری با محاسبه­ ی پهنای پیک­های تشکیل شده در نمونه­‌ها با استفاده از فرمول دبای-شرر (فرمول 1)، برآورد شد:

           

فرمول 1:                        

که β، پهنای پیک­ها در نصف ارتفاع ماکزیمم، λ، طول‌موج اشعه X برابر با 54/1 نانومتر، θ زاویه بین پرتو بازتابش و تابش و D  اندازه دانه­های بلوری می‌باشد. همانطوریکه در شکل ملاحظه می‌شود، در نواحی 13/38، 23/46، 21/64، 47/76 = θ2 نانو ذرات نقره پیک‌های واضحی وجود دارد که دلیلی بر سنتز موفق نانوذرات می‌باشد. آنالیز ساختاری نشان می‌دهد که نانوذرات نقره دارای ساختار بلوری با شاخص‌های میلر (111)، (200)، (220)، (311) در شبکه مکعبی می‌باشد. وجود قله‌های تیز در الگوها نشان‌دهنده درجه بالایی از بلورینگی برای نانوذرات می‌باشد. میانگین اندازه­ی دانه­های بلوری سنتز شده با محاسبه فرمول دبای- شرر 82/24-65/19 نانومتر برآورد شدند که با نتایج حاصل از میکروسکوپ الکترونی عبوری و نتایج به‌دست‌آمده از بررسی طیف اسپکتروفتومتری فرابنفش- مرئی کاملاً مطابقت دارد.

 

 

شکل 6: تصویر پراش پرتو ایکس نانوذرات نقره بیوسنتز شده توسط عصاره گیاه مریم گلی تفتانی

پس از اعمال تمامی شرایط بهینه شده

               


بررسی فعالیت ضدمیکروبی عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی و نانوذرات نقره بیوسنتز شده از آن: نتایج بررسی اثرات ضدمیکروبی عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی نشان داد، عصاره اثر مهار کنندگی قابل قبولی بر روی همه باکتری­ها و قارچ­ها­ی مورد استفاده دارد که با افزایش غلظت عصاره، این اثر مهارکنندگی بیشتر و قطر‌هاله عدم رشد نیز بیشتر می­شود. نتایج حاصل از تأثیر غلظت­های مختلف عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی با روش انتشار چاهکی در جدول 1 نشان داده شد. نتایج نشان می­دهند که عصاره آبی بیشترین و کمترین اثر بازدارندگی را علیه باکتری سالمونلا تیفی موریوم و قارچ آسپرژیلوس فلاووس و باکتری اشرشیاکلی و قارچ پنی سیلیوم اکسپانسوم به ترتیب با قطر‌هاله عدم رشد 15 و 16 میلی­متر و 11 و 13 میلی متر دارد. جدول 2 نتایج مربوط به حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی علیه میکروب­های منتخب به روش رقت لوله­ای را نشان می­دهد. بیشترین حساسیت را در بین باکتری­های مورد آزمایش، باکتری سالمونلا تیفی موریوم (5/12 MIC) و در بین قارچ‌ها، آسپرژیلوس فلاووس (25 MIC) و کمترین حساسیت به عصاره را باکتری اشرشیاکلی و قارچ پنی سیلیوم اکسپانسوم به‌ترتیب (50 MIC) و (50MIC ) دارند.

            نتایج تست­های ضد میکروبی مربوط به نانوذرات نقره بیوسنتز شده با روش­های انتشار چاهکی و تعیین MIC به ترتیب در جدول‌های 3 و 4 ارائه شده است. جدول 3 نشان می‌دهد که، نانوذرات نقره سنتز شده اثر میکروب کشی قابل توجه­ای بر روی نمونه­های مورد آزمایش نشان دادند، به‌طوری‌که حتی در غلظت‌های خیلی کم نیز از رشد باکتری­ها و قارچ­ها جلوگیری کردند و این در حالی است که عصاره آبی گیاه در غلظت­های استفاده شده مربوط به نانوذرات، فاقد هر گونه اثر ضد میکروبی بوده و همچنین اثر ضد میکروبی یون نقره نیز در مقایسه با نانوذرات نقره بسیار کمتر بوده است. نتایج نشان می­دهد که نانوذرات نقره بیشترین و کمترین تأثیر را روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (قطر‌هاله 26 میلی متر) و باکتری سالمونلا تیفی موریوم (قطر‌هاله 19 میلی‌متر) و قارچ آسپرژیلوس فلاووس (قطر‌هاله 22 میلی­متر) و قارچ پنی سیلیوم اکسپانسوم (قطر‌هاله 19 میلی‌متر) داشته است. جدول 4 نتایج مربوط به حداقل غلظت مهارکنندگی رشد (MIC) نانوذرات بیوسنتز شده علیه میکروب­های منتخب به روش رقت لوله­ای را نشان می­دهد. بیشترین حساسیت را در بین باکتری­های مورد آزمایش، باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (125/3 MIC) و در بین قارچ‌ها، آسپرژیلوس فلاووس (25 MIC) و کمترین حساسیت به عصاره را باکتری اشرشیا کلی و قارچ پنی سیلیوم اکسپانسوم به‌ترتیب (25 MIC) و (5/12 MIC ) دارند.

            جدول 5، مقایسه فعالیت ضد میکروبی عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی را با نانوذرات نقره بیوسنتز شده از آن و محلول نیترات نقره در غلظت مشترک 50 میکروگرم بر میلی­لیتر با روش انتشار از چاهک و جدول 6، مقایسه فعالیت ضد میکروبی عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی را با نانوذرات نقره بیوسنتز شده از آن را در غلظت‌های مشترک در روش حداقل غلظت مهارکنندگی (MIC) را نشان می‌دهد. نتایج حاکی از آن است، نانوذرات نقره بیوسنتز شده نسبت به عصاره آبی و محلول نیترات نقره به مراتب دارای فعالیت ضدمیکروبی و اثر میکروب کشی بیشتری می‌باشد.

 

 

جدول 1: قطر‌هاله عدم رشد میکروبی در غلظت­های مختلف عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی با روش انتشار

از چاهک (بر حسب میلی­متر)

میکروارگانیسم­ها

غلظت‌های مختلف عصاره آبی (میکرو­گرم بر میلی­لیتر)

25

50

100

200

400

آمپی سیلین

جنتامیسین

کلوتریمازول

DMSO

استافیلوکوکوس اورئوس

5

7

9

10

13

25

25

_

0

باسیلوس سرئوس

6

8

10

12

14

26

25

_

0

اشرشیا کلی

8

10

11

13

11

26

23

_

0

سالمونلا تیفی موریوم

9

10

13

14

15

26

23

_

0

آسپرژیلوس فلاووس

5

10

12

15

16

_

_

26

 

پنی سیلیوم اکسپانسوم

5

8

8

11

13

_

_

27

 

           

جدول2: حداقل غلظت مهار کنندگی رشد میکروب (MIC) در غلظت­های مختلف عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی

(بر حسب میکروگرم/میلی­لیتر)

میکروارگانیسم­ها

غلظت­های مختلف عصاره آبی (میکرو­گرم بر میلی­لیتر)

56/1

12/3

25/6

5/12

25

50

100

200

استافیلوکوکوس اورئوس

*+

+

+

+

-**

-

-

-

باسیلوس سرئوس

+

+

+

+

-

-

-

-

اشرشیا کلی

+

+

+

+

+

-

-

-

سالمونلا تیفی موریوم

+

+

+

-

-

-

-

-

آسپرژیلوس فلاووس

+

+

+

+

-

-

-

-

پنی سیلیوم اکسپانسوم

+

+

+

+

+

-

-

-

* توانایی رشد میکروارگانیسم در حضور غلظت مشخص عصاره آبی

** عدم توانایی رشد میکروارگانیسم در حضور غلظت مشخص عصاره آبی

جدول 3: قطر‌هاله عدم رشد میکروبی در غلظت­های مختلف نانوذرات نقره با روش انتشار از چاهک (بر حسب میلی­متر)

میکروارگانیسم­ها

غلظت‌های مختلف نانوذرات نقره (میکروگرم بر میلی­لیتر)

10

20

40

60

100

محلول نمک نقره (µg/ml50)

آمپی سیلین

( µg/ml50)

جنتامیسین

( µg/ml50)

کلوتریمازول

( µg/ml50)

استافیلوکوکوس اورئوس

13

15

17

20

26

7

28

29

_

باسیلوس سرئوس

11

13

14

18

23

11

29

27

_

اشرشیا کلی

5

11

15

18

20

13

28

26

_

سالمونلا تیفی موریوم

12

14

16

17

19

12

29

27

_

آسپرژیلوس فلاووس

12

14

17

20

22

12

-

-

28

پنی سیلیوم اکسپانسوم

5

10

13

17

19

10

-

-

27

 

جدول 4: حداقل غلظت مهار کننده رشد میکروب (MIC) در غلظت­های مختلف نانوذرات نقره (بر حسب میکروگرم/میلی­لیتر)

میکرو ارگانیسم­ها

غلظت‌های مختلف نانوذرات نقره (میکروگرم بر میلی­لیتر)

78/0

56/1

12/3

25/6

5/12

25

50

100

200

400

استافیلوکوکوس اورئوس

*+

+

**-

-

-

-

-

-

-

-

باسیلوس سرئوس

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

اشرشیا کلی

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

سالمونلا تیفی موریوم

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

آسپرژیلوس فلاووس

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

پنی سیلیوم اکسپانسوم

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

* توانایی رشد میکروارگانیسم در حضور غلظت مشخص نانوذرات نقره

** عدم توانایی رشد میکروارگانیسم در حضور غلظت مشخص نانوذرات نقره

 

جدول 5: مقایسه قطر‌هاله عدم رشد میکروبی عصاره آبی گیاه مریم کلی تفتانی و نانوذرات نقره بیوسنتز شده از آن در غلظت مشترک 50 میکروگرم بر میلی­لیتر با روش انتشار از چاهک (برحسب میلی­متر)

میکروارگانیسم­ها

نمونه‌ها

عصاره آبی

( µg/ml50)

نانوذرات نقره

(µg/ml50)

محلول نمک نقره

( µg/ml50)

آمپی سیلین

(µg/ml50)

جنتامیسین

( µg/ml50)

کلوتریمازول

( µg/ml50)

استافیلوکوکوس اورئوس

7

19

7

28

29

-

باسیلوس سرئوس

8

16

11

29

27

-

اشرشیا کلی

10

17

13

28

26

-

سالمونلا تیفی موریوم

10

16

12

29

27

-

آسپرژیلوس فلاووس

10

19

12

-

-

28

پنی سیلیوم اکسپانسوم

8

15

10

-

-

27

 

 

جدول 6: مقایسه حداقل غلظت مهار کنندگی رشد میکروب (MIC) در غلظت­های مشترک عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی و نانوذرات نقره بیوسنتز شده از آن (بر حسب میکرو­گرم/میلی­لیتر)

میکروارگانیسم­ها

غلظت­های مشترک عصاره آبی و نانوذرات نقره بیوسنتز شده از آن (میکروگرم بر میلی­لیتر)

 

56/1

12/3

25/6

5/12

25

50

100

200

استافیلوکوکوس اورئوس

عصاره آبی

*+

+

+

+

-**

-

-

-

نانوذرات نقره

+

-

-

-

-

-

-

-

باسیلوس سرئوس

عصاره آبی

+

+

+

+

-

-

-

-

نانوذرات نقره

+

+

-

-

-

-

-

-

اشرشیا کلی

عصاره آبی

+

+

+

+

+

-

-

-

نانوذرات نقره

+

+

-

-

-

-

-

-

سالمونلا تیفی موریوم

عصاره آبی

+

+

+

-

-

-

-

-

نانوذرات نقره

+

+

+

-

-

-

-

-

آسپرژیلوس فلاووس

عصاره آبی

+

+

-

+

-

-

-

-

نانوذرات نقره

+

+

+

-

-

-

-

-

پنی سیلیوم اکسپانسوم

عصاره آبی

+

+

+

+

+

-

-

-

نانوذرات نقره

+

+

+

-

-

-

-

-

* توانایی رشد میکروارگانیسم در حضور غلظت مشخص عصاره آبی و نانوذرات نقره

** عدم توانایی رشد میکروارگانیسم در حضور غلظت مشخص عصاره آبی و نانوذرات نقره

 


بحث

            در این مطالعه نانوذرات نقره با روش زیستی و دوستدار محیط زیست و بدون استفاده از هرگونه مواد شیمیایی خطرناک تولیدشده است. استفاده از ظرفیت بالای گیاهان ما را در دست یافتن به نانوذراتی با پایداری خیلی بیشتر از روشهای شیمیایی می‌رساند. سنتز زیستی نانوذرات تولیدشده توسط گیاهان دارویی می­تواند در موارد متنوعی ازجمله انتقال داروها در بدن استفاده شود. از مزایای این روش، به ساده و کم­هزینه بودن، امکان تولید نانوذرات با اشکال مختلف و اندازه یکسان می­توان اشاره کرد. روش مذکور نسبت به دو روش دیگر سنتز نانوذرات (فیزیکی وشمیایی)، دارای راندمان بالاتر و تقریبا فاقد معایب است. مطالعه حاضر بر روی ریشه‌های گیاه مریم گلی نفتانی (Salvia rhytidea) صورت گرفته است. مطالعات نشان می دهد، ریشه این گیاه دارای فعالیت‌های زیستی همچون: فعالیت آنتی اکسیدانی، ضدمیکروبی، ضد قارچی، سمیت می باشد (Jassbi et al., 2015). در مطالعه ای دیگر، از ریشه این گیاه ترکیبات:Sahandinone ، 12-deoxysalvipisone، miltirone ، 7-α-acetoxyroyleanone ، labda-7,14-dien-13-ol، جدا شد. اثرات بیولوژیکی این ترکیبات بعنوان ترکیبات آنتی اکسیدانی، ضد میکروبی، سمیت و ضد مالاریا اثبات شده است. ترکیبات اول و سوم دو ماده سرطان زا بسیار قوی با عملکرد بالا هستند (Jassbi et al., 2017) و از مهمترین علت انتخاب ریشه این گیاه جهت مطالعه و سنتز نانوذرات نقره، وجود ترکیبات و فعالیت‌های بیولوژیکی مذکور بوده است. بگونه ای که مطالعات نشان می دهد گیاهان دارای فعالیت‌های بیولوژیکی بالا خصوصا آنتی اکسیدانی بالا، توانایی احیای یون‌های فلزی و تبدیل آن‌ها به اتم‌های فلزی درابعاد نانومتریک را دارند و بهترین گزینه جهت احیای زیستی هستند (Azizian-Shermeh et al., 2017 a ; Azizian-Shermeh et al., 2017 b; Azizian-Shermeh et al., 2017 c ). یکی از محدودیت­ها در اکثر روش­های سنتز نانوذرات، پراکنش زیاد نانوذرات در دامنه وسیع از اندازه­ها در ابعاد نانومتریک است. این محدودیت بزرگ را می­توان با روش­های مختلف از قبیل بهینه pH، تغییرات غلظت­های مختلف محلول نمکی و مدت زمان رفع کرد و دامنه تغییرات اندازه نانوذرات را کاهش داد و به یک شرایط بهینه و مناسب دست پیدا کرد (Etemadi et al., 2017). طیف جذبی نوری نانوذرات فلزی به چندین فاکتور مانند: اندازه ذرات، شکل، برهمکنش ذرات با یکدیگر و ضریب شکست محیط حساس است. pH یکی از مهمترین پارامتر‌های موثر بر سنتز نانوذرات طلا می باشد. پیش از این گزارش­هایی مبنی بر تاثیر pH واکنش بر تنوع اندازه و شکل نانوذرات ارائه شده است (Azizian-Shermeh et al., 2016 b). همچنین گزارش‌ها حاکی از آن است که pH بر روی شکل نانوذرات تأثیر چشمگیری ندارد و تنها اندازه آن­ها به میزان زیاد تحت تأثیر قرار می دهد (Azizian-Shermeh et al., 2017 b). با توجه به یافته‌های مربوط به بهینه pH، مشاهده شد که در 2 pH=  تغییر قابل ملاحظه­ای در جذب ملاحظه نشده به گونه­ای که می توان ادعا نمود که سنتز قابل ملاحظه ای صورت نگرفته است. اما  با افزایش تدریجی میزان pH محلول تا 8، جذب محلول حاصل افزایش می­یابد که مربوط به افزایش در میزان سنتز نانوذرات است. در 8 pH=، پیک شارپی ملاحظه می­شود. اینگونه به نظر می­رسد که در pH بالای 8 (10pH=) یون‌های نقره هیدرولیز شده به گونه ای که موجب بوجود آمدن گونه‌های پایدار هیدروکسیدهای یون نقره می­شود و در انتها از ورود این یون به واکنش احیای بیولوژیکی و زیستی ممانعت می­شود (Gardea-Torresdey, 1999 , Shenya et al., 2011). در نتیجه مقدار 10 pH= بعنوان اسیدیته بهینه انتخاب شد.  در سنتز نانوذرات بوسیله عصاره گیاهان، عصاره نقش کاهندگی و احیا کردن یون‌های فلزی و همچنین پایدار کردن این نانوذرات را ایفا می­کند (Shankar et al., 2002). به محض اضافه کردن واکنشگرها و رسانیدن اسیدیته محلول به 8، مشاهده شد که رنگ محلول به قهوه­ای تیره تغییر کرده است که نشان دهنده سنتز موفق نانوذرات نقره می­باشد. شکل 1 نشان می­دهد که نانوذرات سنتز شده در 410 نانومتر دارای ماکسیمم جذب هستند که این طول موج مربوط به رزونانس پلاسمون سطحی نانوذرات نقره است. لیکن در این طول موج، عصاره هیچ جذبی ندارد و این مشاهده دلیلی بر وجود نانوذرات نقره در محیط و عدم دخالت عصاره در طیف حاصل از نانوذرات نقره سنتز شده دارد. گزارشات نشان می­دهند که افزایش جذب در اثر افزایش غلظت یون فلزی بدین دلیل است که یون‌ها بیشتر در معرض عمل کاهش قرار خواهند گرفت و نانوذرات بیشتری تولید خواهد شد (Azizian-Shermeh et al., 2017 c). پژوهش­های متعددی تأثیر غلظت یون فلزی بر سنتز نانوذرات را اثبات کرده اند. مطالعات نشان می­دهد با افزایش غلظت یون فلز، جذب مشاهده شده نیز افزایش می­یابد که این پدیده بدین علت است که با افزایش مقدار یون فلز، یون­های بیشتری احیاء شده و نتیجتاً نانوذرات بیشتری تولید خواهد شد (Dwivedi and Gopal, 2010). اما کاهش بیش از حد یا افزایش نامحسوس در مقدار جذب مربوط به نانوذرات در اثر افزایش بیش از اندازه غلظت یون نقره، می­تواند بدلیل چسبندگی نانوذرات و سنتز نانوذراتی با اندازه بزرگتر باشد (Mock et al., 2002). با توجه به دلایل ذکر شده غلطت 4 میلی­مولاری از یون نقره بعنوان غلظت مناسب انتخاب شد. زمان نیز همانند فاکتورهای مورد بحث، تأثیر بسزایی در سنتز و پایدار بودن نانوذرات دارد (Philip, 2010)، بطوریکه در واکنش‌های اینچنینی، اگر سنتز کامل انجام نشده باشد، با گذشت زمان تولید نانوذرات بیشتر خواهد بود. همچنین عامل زمان، مهمترین فاکتور برای اثبات پایداری نانوذرات سنتز شده می­باشد  (Azizian-Shermeh et al., 2017 a)، بگونه­ای که اگر با گذشت زمان، افزایش قابل توجه­ای در میزان جذب نانوذرات نقره ملاحظه نشود، می­توان اینگونه استنباط کرد که نانوذرات حاصل با گذر زمان کاملاً پایدار هستند. با توجه به دلایل عنوان شده، واکنش احیای یون‌های نقره توسط عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی در 12 ساعت کامل شده است. مقاومت روز افزون باکتری‌های بیماری­زا نسبت به آنتی بیوتیک­های متداول موجود در بازار و شیوع بیماری­های عفونی که جهت درمان نیاز به آن داروها دارند و نیز توانایی بالقوه برخی از گیاهان جهت تولید مواد ضد میکروبی باعث گرایش محققان به جایگزینی گیاهان دارویی با آنتی بیوتیک­ها شده است. در مطالعه حاضر اثر ضدمیکروبی نانوذرات نقره سنتز شده و عصاره آبی گیاه مورد نظر توسط دو روش اتنشار دیسک در آگار و MIC بررسی شد. نتایج نشان می­دهند که عصاره آبی بیشترین و کمترین  اثر بازدارندگی را علیه باکتری سالمونلا تیفی موریوم و قارچ آسپرژیلوس فلاووس و باکتری اشرشیاکلی و قارچ پنی سیلیوم اکسپانسوم به ترتیب با قطر‌هاله عدم رشد 15 و 16 میلی­متر و 11 و 13 میلی متر دارد. در روش MIC، عصاره آبی بیشترین حساسیت را در بین باکتری­های مورد آزمایش، باکتری سالمونلا تیفی موریوم (5/12 MIC) و در بین قارچ‌ها، آسپرژیلوس فلاووس (25 MIC) و کمترین حساسیت به عصاره را باکتری اشرشیاکلی و قارچ پنی سیلیوم اکسپانسوم به‌ترتیب (50 MIC) و (50 MIC ) دارند. همچنین نانوذرات نقره سنتز شده در این روش دارای بیشترین اثر مهارکنندگی علیه باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (26 میلی‌متر) و قارچ آسپرژیلوس فلاووس (22 میلی‌متر) و کمترین اثر مهارکنندگی علیه باکتری سالمونلا تیفی موریوم (19 میلی‌متر) و قارچ پنی سیلیوم اکسپانسوم (19 میلی‌متر) داشته است. در بررسی اثر مهارکنندگی نانوذرات در روش MIC ، نانوذرات بیشترین حساسیت را در بین باکتری­های مورد آزمایش، باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (125/3 MIC) و در بین قارچ‌ها، آسپرژیلوس فلاووس (25 MIC) و کمترین حساسیت به عصاره را باکتری اشرشیا کلی و قارچ پنی سیلیوم اکسپانسوم به‌ترتیب (25 MIC) و (5/12 MIC) دارند. در مقایسه قطر‌هاله عدم رشد میکروبی عصاره آبی و نانوذرات نقره بیوسنتز شده از آن در غلظت مشترک 50 میکروگرم بر میلی لیتر با روش انتشار از چاهک، نانوذرات نقره دارای بیشترین اثر مهارکنندگی علیه باکتری استافیلووکوکوس اورئوس (19 میلی‌متر) و قارچ آسپرژیلوس فلاووس (19 میلی‌متر) بوده است. در صورتی که این اثر مهارکنندگی برای عصاره آبی در همین غلظت مشترک و برابر با باکتری استافیلووکوکوس اورئوس (7 میلی‌متر) و قارچ آسپرژیلوس فلاووس (10 میلی‌متر) بوده است. مطالعات نشان می دهد که اسانس و عصاره‌های مختلف گیاه مریم گلی تفتانی دارای فعالیت ضدمیکروبی و میکروب کشی نسبتاً قابل قبولی دارد (Azizian-Shermeh et al., 2018 a, Salari et al., 2016; Jassbi et al., 2015). همچنین، گزارشات حاکی از آن است که گیاه مریم گلی تفتانی با دارا بودن ترکیبات موثره، فدرت آنتی اکسیدانی بالایی داشته و این خود توان این گیاه را در احیای یون‌های فلزی و تبدیل آن‌ها به اتم‌های فلزی در ابعاد نانومتریک ثابت می کند (Azizian-Shermeh et al., 2018 a). مطالعات مختلف نشان می دهد که گونه‌های مختلف مریم گلی (Salvia) با داشتن مقادیر بالای ترکیبات فنولی هموارده به عنوان یکی از مهمترین منابع آنتی اکسیدانی طبیعی مورد توجه و مطالعه بوده اند (Farhat et al., 2013). بررسی‌ها حاکی از آن هستند که، با افزایش میزان غلظت عصاره، اثر مهارکنندگی و عدم رشد علیه باکتری‌های استافیلوکوکوس اورئوس و اشرشیا کلی بیشتر شده است که کاملا با نتایج حاصل از پژوهش حاضر مطابقت دارد (Mazaraie et al., 2018). اثر وسیع آنتی باکتریال و ضد قارچ مریم گلی بر طیف وسیعی از باکتری‌ها مانند سودوموناس و آسپرژیلوس و کاندیدا گزارش شده است (Amiri et al.,2012). در مطالعه سمیت سلولی و فعالیت ضد میکروبی گلهای
Salvia officinalis L.، نتایج نشان دادند که، عصاره متانول حاوی گلیکوزیدهای قلبی، فلاونوئیدها، ساپونین‌ها و آلکالوئیدها بوده است. فعالیت‌های ضد باکتریایی این عصاره در برابر استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس استاروترموفیلوس ، میکروکوکوس لوتئوس، اشرشیا کلی و باسیلوس سرئوس عصاره متانولی 70% فعالیت ضد میکروبی قوی تری نسبت به آبی دارد (Elmageed & Hussein, 2008). در پژوهشی دیگر که بر روی فعالیت ضد میکروبی غلظت غیر سمیت سلولی عصاره میرم گلی  (Salvia officinalis) در برابر گونه‌های باکتریایی و قارچی از حفره دهان انجام شد، نتایج نشان داد که عصاره متانولی با غلظت 50  میلی‌گرم در میلی لیتر در برابر کلیه میکروارگانیسم‌ها مؤثر بوده است (Oliveira et al., 2019). در تحقیقی مشابه که بر روی فعالیت ضد قارچی بخشهای مختلف گیاه مریم گلی تفتانی به عنوان یک گیاه دارویی با ارزش در برابر گونه‌های مختلف کاندیدا در استان کرمان انجان شد، نتایج حاکی از آن بود که، عصاره متانولی دارای بیشتر حساسیت علیه گونه‌های مختلف قارچ کاندیدا بوده است (Zahabi et al., 2020).

            تاکنون مطالعات متعددی جهت تعیین مکانیسم اثر نانوذرات بر روی باکتری انجام گرفته است. پژوهش‌های بسیاری، مبتنی بر واکنش­های احتمالی بین نانوذرات با ماکرومولکول­های موجودات زنده نشان می­دهد که اختلاف بین بار منفی میکروارگانیسم و بار مثبت نانوذرات فلزی، بصورت یک الکترومغناطیس جاذب بین میکروب و نانوذرات عمل کرده و باعث اتصال نانوذرات به سطح سلول شده و در نتیجه می‌تواند باعث مرگ سلول شود (Azizian-Shermeh et al., 2018 b). همچنین تشکیل کلونی، رشد سلول باکتری و تشکیل ماتریکس­های فیلم زیستی فشرده میکروبی باعث ایجاد عفونت می­شوند و نانوذرات از تشکیل این عامل­های دفاعی میکروب­ها در برابر سامانه ایمنی سلول میزبان جلوگیری می­کنند (Basiri et al., 2011; Philip, 2009). مطالعات مختلفی درمورد اثرات ضدمیکروبی نانوذرات فلزی خصوصاً نانوذرات نقره صورت گرفته است. تعدادی از پژوهشگران فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات نقره را روی E.coli وابسته به غلظت نانوذرات اعلام کردند (Praveen et al., 2007). در مطالعه دیگری محققان در سال 2011 نشان دادند که اثرات نانوذرات نقره بر رویE.coli بیشتر از S.aureus می­باشد (Vijayaraghavana et al., 2011). در گزارشی دیگر با بررسی فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات نقره روی باکتری­های مختلف مانند E.coli، P.aeroginosa و S.aureus  مشخص شد که هرچند فعالیت نانوذرات وابسته به غلظت است ولی برای باکتری­های گرم منفی به نسبت گرم مثبت این اثر چشمگیرتر بوده است (Yougsong et al., 2009; Ankamwar, 2010; Rimal et al., 2013). در واقع تفاوت پاسخ باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی به نانوذرات نقره، به تفاوت موجود در ساختار دیواره سلولی آنها مربوط می­باشد، بطوریکه باکتری­های گرم منفی دیواره سلولی نازکتر و با استحکام کمتر داشته و نیز وجود لایه ای از لیپو پلی ساکارید در سطح بیرونی شان که سرشار از بارهای منفی است برهمکنش بین نانوذرات نقره که دارای بار مثبت ضعیف می­باشند را با این سلول­های باکتریایی تسهیل می­کند. اتصال نانوذرات به سطح سلول ابتدا دیواره را سوراخ و سپس با ورود نانوذره به داخل سلول باکتری و ایجاد تداخل در مسیرهای مختلف متابولیکی و تولیدمثل در نهایت منجر به مرگ باکتری می­شود (Azizian-Shermeh et al., 2019). همچنین غلظت­های متفاوت عصاره نیز در میزان اثر مهارکنندگی موثر است که در مطالعات متعددی به آن اشاره شده است که با افزایش میزان غلظت عصاره، اثرات ضدمیکروبی گیاه و‌هاله عدم رشد نیز افزایش می­یابد که این مورد کاملا هم سو با نتایج حاصل از مطالعه حاضر بوده است بگونه ای که اثر مهار کنندگی عصاره و نانوذرات نقره سنتز شده کاملا وابسته به غلظت بوده است (Ebrahimi et al., 2012). با افزایش بیماری­های غذایی، همراه با مشکلات اجتماعی و اقتصادی حاصل و پیشرفت مقاومت آن­ها به آنتی بیوتیک­های مختلف، محققین و داروسازان و صنایع وابسته به مواد غذایی را به سمت استفاده از نانوتکنولوژی سوق داده است. تحقیقات نشان داده است که اندازه نانوذرات در اثر ضدمیکروبی آن­ها بسیار تاثیرگذار است و هرچه این اندازه کوچکتر باشد، اثر ضدمیکروبی بیشتری از خود نشان می­دهد به علاوه نوع باکتری نیز در حساسیت به نانوذرات موثر است (Clara et al., 2011). بگونه­ای که طبق یافته‌های برخی از پژوهشگران، نانوذرات نقره با اندازه 20-1 نانومتر در صورتی که به یکدیگر نچسبیده باشند، دارای بیشترین اثر ضدمیکروبی است (Fernandez et al., 2010). تاکنون مطالعات متعددی جهت تعیین مکانیسم اثر نانوذرات بر روی میکروارگانیسم­ها انجام گرفته است. مطالعات نشان می‌دهد که نانوذرات نقره بیشترین تأثیر را روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (قطر ‌هاله 24 میلی متر و µg/ml12/3 MIC) و قارچ آسپرژیلوس فلاووس (قطر‌هاله 21 میلی متر و µg/ml 25/6 MIC) داشته و کمترین تاثیر را روی باکتری اشرشیا کلی (قطر‌هاله 18 میلی متر و و µg/ml 25 MIC) داشته است. به عبارت دیگر، اشرشیا کلی در مقایسه به استافیلوکوکوس اورئوس مقاومت بیشتری نسبت به حضور نانوذرات نقره نشان داده است. دلیل مقاومت بیشتر اشرشیا کلی نسبت به استافیلوکوکوس اورئوس تفاوت بین ساختار غشا باکتری­های مورد نظر می­باشد و تفاوت در ضخامت پپتیدوگلیکان آن­ها است (Kim et al., 2007; Feng et al., 2000). پژوهش­های بسیاری، مبتنی بر واکنش­های احتمالی بین نانوذرات با ماکرومولکول­های موجودات زنده نشان می­دهد که اختلاف بین بار منفی میکروارگانیسم و بار مثبت نانوذرات فلزی، بصورت یک الکترومغناطیس جاذب بین میکروب و نانوذرات عمل کرده و باعث اتصال نانوذرات به سطح سلول شده و در نتیجه می­تواند باعث مرگ سلول شود (Chaloupka et al., 2010). در پی آزاد سازی تدریجی یون­های نقره، این یون‌ها می توانند به گروه‌های دهنده الکترون مانند گوگرد، اکسیژن و نیتروژن در مولکول‌های زیستی موجود در میکرورگانیسم­ها متصل شوند (Asadi et al., 2014). مطالعات مختلفی درمورد اثرات ضدمیکروبی نانوذرات فلزی خصوصاً نانوذرات نقره صورت گرفته است. چو و همکاران در سال 2005 اعلام کردند که غلظت ppm 10 و 5 به ترتیب برای استافیلوکوکس اورئوس و اشرشیا کلی کمترین علظت بازدارندگی است اما غلظت ppm 50 برای استافیلوکوکس اورئوس و ppm 100 برای اشرشیا کلی، کشته است (Cho et al., 2005). در مطالعه انجام شده بر روی فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات نقره بر روی باکتری‌های استافیلوکوکوس‌اورئوس، باسیلوس‌سرئوس، اشریشیا‌کُلی و سودوموناس‌آئروژینوزا ، یافته­ها نشان داد که این فعالیت وابسته به غلظت نانوذرات بوده­است (Zarei et al., 2018). در مطالعه دیگر، نشان داده شد که اثرات نانوذرات نقره بر روی اشرشیا کلی بیشتر از استافیلوکوکوس اورئوس می­باشد (Monteiro et al., 2009). در مطالعاتی دیگر با بررسی فعالیت ضدمیکروبی نانوذرات نقره روی باکتری­های مختلف مانند E.coli، P.aeroginosa و S.aureus مشاهده شد که هرچند فعالیت نانوذرات وابسته به غلظت است ولی برای باکتری­های گرم منفی به نسبت گرم مثبت این اثر چشمگیرتر بوده است (Dwivedi and Gopal, 2010). قابل ذکر است که غلظت نانوذره، اندازه و شکل نانوذره، سوش میکروبی و روش تولید نانوذره بر اثر ضدمیکروبی نانوذرات نقره موثر است (Azizian-Shermeh et al., 2018 b). البته گزارشاتی نیز مبنی بر استفاده از سایر نانوذرات جهت ارتقا کیفیت و سلامتی مواد غذای و از بین بردن پاتوژن­های بیماری­زا با منشا غذایی گزارش شده است (Azizian-Shermeh et al., 2019). علاوه بر مواد غذایی، استفاده از نانوذرات نقره جهت کاهش بار میکروبی آب آشامیدنی نیز بررسی شده است (Heidarpour et al., 2010).

 

نتیجه‌گیری نهایی

            نتایج حاصل از این مطالعه و مطالعات دیگر نشان می دهد که خواص ضدمیکروبی نانوذرات نقره برای گونه­های متفاوت باکتریایی و قارچ­های مورد مطالعه متفاوت و منحصر به فرد است. همچنین، نانوذرات نقره سنتز شده از عصاره آبی گیاه مریم گلی تفتانی، به
مراتب اثر مهارکنندگی و میکروب کشی بیشتری نسبت به عصاره آبی آن دارد. مقاومت نسبی برخی از گونه­ها می تواند به خاطر ساختار غشای مقاوم در برابر خاصیت ضدمیکروبی نقره باشد. به همین خاطر باید غلظت نانوذرات نقره به کار برده شده در پوشش‌های نانویی (تا حداکثر مجاز اعلام شده توسط اتحادیه اروپا) با توجه به میزان مقاومت گونه­های بیماری­زا در برابر نقره تعیین گردد تا بار میکروبی مواد غذایی پس از گذشت بازه زمانی مورد نظر از حد مجاز تجاوز نکند. نانوذرات دارای نسبت سطح به حجم بسیار زیادی هستند و در مورد نقره به طور خاص، این افزایش سطح باعث شده که یک گرم نانوذرات نقره برای کشتن باکتری­های صد مترمربع از یک سطح کافی باشد. ویژگی نانوذرات نقره از لحاظ شکل و اندازه باعث شده که این نانوذرات بتوانند با تخریب غشاء فعالیت ضدمیکروبی بالایی از خود نشان دهند و مجموعه این خصوصیات باعث کاربرد فراوان نانوذرات نقره در پزشکی و بهداشت مانند ضد عفونی کردن آب­های آشامیدنی، استفاده در فیلترهای کربنی و از بین بردن میکروب­های هوا شده است. همچنین این نانوذرات امروزه به عنوان پوشش­های ضدمیکروب در تجهیزات پزشکی و نیز تولید ژل‌های ضدمیکروب در درمان سوختگی­ها و در صنایع مختلف همچون صنعت مهم غذایی در فیلترهای ضدعفونی کننده موادغذایی، پوشش­ها و بسته­بندی موادغذایی و پاکسازی خطوط تولید موادغذایی استفاده می­شوند.

 

تشکر و قدردانی

            پژوهشگران بر خود لازم می­دانند، مراتب تشکر و قدردانی خود را نسبت به حمایت­های دانشگاه سیستان و بلوچستان در جهت اجرا و اتمام این پژوهش اعلام نمایند.

 

 

 

 

 

 

 

 



*نویسنده مسئول: mollashahi39@chem.usb.ac.ir

[2]. Salmonella tifimurium PTCC 1609

[3]. Escherichia coli PTCC 1763

[4]. Bacillus cereus PTCC 1154

[5]. Staphylococcus aureus PTCC 1431

[6]. Aspergilus Flavus PTCC 5004

[7]. Penicillium expansum PTCC 5251

[8]. Persian Type Culture Collection- PTCC 

References

1.Amiri, H. 2007. Quantitative and qualitative changes of essential oil of Salvia bracteata Bank et Sol. in different growth stages. DARU-Journal of Faculty of Pharmacy, 15: 79-82.

2.Amiri, H. 2012. Investigation of chemical compounds and antioxidant activity of essential oil and methanolic extracts of Salvia multicaulis, Journal of Medicinal Plant, 8: 111-117. (In Persian)

3.Asadi, M., Khosravi-Darani, K., Mortazavi, A., Hajseyed Javadi, N., Azadnia, E. and Kiani Harchegani, A. 2014. Antimicrobial effect of silver nanoparticles produced by chemical reduction on Staphylococcus aureus and Escheirchia coli. Iranian Journal of Nutrition Sciences & Food Technology, 8 (4):83-92 (In Persian)

4.Ashiri, S., Safari, J. 2013. Synthesis of gold and silver nanoparticles in plant substrates and their application. Nanotechnology, 1(186): 12-15. (In Persian)

5.Ankamwar., B. 2010. Biosynthesis of Gold Nanoparticles (Green-Gold) Using Leaf Extract of Terminalia catappa. E-Journal of Chemistry, 7(4):1334-1339.

6.Aubourg, S.P., Piñeiro, C., Gallardo, J. M. and Barros-Velazquez, J. 2005. Biochemical changes and quality loss during chilled storage of farmed turbot (Psetta maxima). Food Chemistry, 90(3): 445-52.

7.Azizian Shermeh, O, Valizadeh, J., Noroozifar, M. and Qasemi, A. 2016 a. Investigation the antimicrobial activity of silver nanoparticles biosynthesis by aqueous extract of Sambucus ebulus L. Journal of Ilam University of Medical Sciences, 25(4): 92-108. (In Persian)

8.Azizian shermeh, O., Valizadeh, J., Noroozifar, M., Ghasemi, A. and Valizadeh, M. 2016 b. Optimization, characterization and anti-microbial activity of gold nanoparticles biosynthesized using aqueous extract of Sambucus ebulus L. Eco-phytochemical Journal of Medicinal plants, 1:1-18. (In Persian)

9.Azizian Shermeh, O., Einali, A. and Ghasemi, A. 2017 a. Rapid biologically one-step synthesis of stable bioactive silver nanoparticles using Osage orange (Maclura pomifera) leaf extract and their antimicrobial activities. Advanced Powder Techmology, 28: 3164-3171

10.Azizian Shermeh, O., Valizadeh, M., Valizadeh, J., Taherizadeh, M. and Beigomi, M. 2017 b. Phytochemical investigation and phytosynthesis of silver nanoparticles using aqueous extract of Capparis spinosa L. Journal of Modares Biological Sciences (JMBS), 8 (1): 80-90 (In Persian)

11.Azizian Shermeh, O., Taherizadeh, M., Valizadeh, M., Valizadeh, J., Qasemi, A. and Naroei, B. 2017 c. Optimization, characterization, and investigation of antibacterial activity of gold Nanoparticles biosynthesized by aqueous extract of Seidlitzia rosmarinus. Qom Univercity of Medical Sciences Journal, 11 (5): 38-52 (In Persian)

12.Azizian Shermeh, O., Taherizadeh, M., Valizadeh, M. and Qasemi, A. 2018 a. Robial and antioxidant activities and Determining Phenolic and flavonoid contents of the extracts of five species from different families of the medicinal plants grown in Sistan and Baluchestan Province. Journal of Fasa University of Medical Sciences, 7(4): 465-479

13.Azizian Shermeh, O., Valizadeh, M., Taherizadeh, M. and Beigomi, M. 2018 b. Phytochemical investigation and phytosynthesis of eco-friendly stable bioactive gold and silver nanoparticles using petal extract of saffron (Crocus sativus L.) and study of their antimicrobial activities. Applied Nanoscience. https://doi.org/10.1007 /s13204-019-01059-5

14.Azizian Shermeh, O., Taherizadeh, M., Valizadeh, M., Ghasemi, A., Beigomi, M. and Kamali Deljoo, A. 2019. The study of antimicrobial effect of silver nanoparticles biosynthesized by the leaf aqueous extract of kelussia odoratissima mozaff. against some pathogenic microbes with food sources. Journal of Food Technology and Nutrition, 16 (1): 31-48 (In Persian)

15.Basiri, Sh. 2011. Investigation of the effect of temperature and air velocity in the dryer on the amount and quality of essential oil of Thymus. Innovation in Food Science and Technology (Journal of Food Science and Technology), 3(4): 75-85. (In Persian)

16.Cao, Y.W.C., Jin, R.C. and Mirkin, C.A. 2002. Nanoparticles with Raman spectroscopic fingerprints for DNA and RNA detection. Science, 297: 1536-1540.

17.Chaloupka‌, K., Malam, Y. and Seifalian, A.M. 2010. Nanosilver as a new generation of nanoproduct in biomedical applications. Trends in Biotechnology, 28: 580-588.

18.Chaloupka‌, K., Malam, Y. and Seifalian, A.M. 2010. Nanosilver as a new generation of nanoproduct in biomedical applications. Trends in Biotechnology, 28 (11): 580-588.

19.Clara, S., Donatella, D. and Sossio, C. 2011. Food packaging based on polymer nanomaterials. Progress in Polymer Science, 36(12): 1766-82. 9.

20.Cho, K.H., Park, J.E., Osaka, T. and Park, S. 2005. The study of antimicrobial activity and preservative effects of nanosilver ingredient. Electrochim Acta, 51: 956-960.

21.Christian, P., Von der Kammer, F., Baalousha, M. and Hofmann, T. 2008. Nanoparticles: Structure, Properties, Preparation and Behaviour in Environmental Media. Ecotoxicology, 17(5): 326-343.

22.Chung, N., Chu, P. 2010. Effect of nano-packing on preservation quality of fresh strawberry (Fragaria ananassa L.) during storage. Food Chemistry, 110: 16248-1625.

23.Ding, C.K., Chachin, K., Ueda, Y. and Imahori, Y. 1998.  Purification and properties of polyphenol oxidase from loquat fruit. Journal of Agricultural Food Chemistry, 46(10): 4144 - 49.

24.Dwivedi, A.D. and Gopal, K. 2010. Biosynthesis of silver and gold nanoparticles using Chenopodium album leaf extract. Colloids and Surfaces A, 369(3): 27–33.

25.Ebrahimi, A., Khayami, M. and Nejati, V. 2012. Comparison of antimicrobial effect of different parts of Quercus persica against Escherichia coli O157:H7. The Horizon of Medical Scinces. 17 (4): 11-17 (In Persian)

26.Ebrahimi Asl, S. and Zarei, A. 2015. Synthesis and characterization of ag/chitosan nanobiocomposite by chemical method and investigation of its application for food packaging. Journal of Food Microbiology, 2(2): 21-31 (In Persian)

27.Elmageed, M.A. and Hussein, B. 2008. Cytotoxicity and antimicrobial activity of Salvia officinalis L. flowers, Sudan Journal of Medical Sciences, 3(2): 127-132

29.Farhat, M.B., Landoulsi, A., Chaouch-Hamada, R., Sotomayor, J.A. and Jordn, M.J. 2013. Characterization and quantification of phenolic compounds and antioxidant properties of Salvia species growing in different habitats. Industrial Crops and Products, 49: 904-14.

30.Fan, W., Sun, J., Chen, Y., Qiu, J., Zhang, Y. and Chi, Y. 2009. Effects of chitosan coating on quality and shelf life of silver carp during frozen storage. Food Chemistry, 115(1): 66-70.

31.Feng, Q.L., Wu, J., Chen, G.O., Cui, F. Z., Kim, T.N. and Kim, J.O. 2000. A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Journal of Biomedical Materials Research, 52(4): 662-8.

32.Fernández, A., Soriano, E., López-Carballo, G., Picouet, P., Lloret, E., Gavara, R. and Hernandez-Munoz, P. 2009. Preservation of aseptic conditions in absorbent pads by using silver nanotechnology. Food Research International, 42(8): 1105-12.

33.Fernández, A., Picouet, P. and Loret, E. 2010. Cellulose-silver nanoparticle hybrid materials to control spoilage-related microflora in absorbent pads located in trays of fresh-cut melon. International Journal of Food Microbialogy, 142(1-2): 222-8.

34.Furno, F., Morley, K.S., Wong, B., Sharp B.L., Arnold, P.L., Howdle, S.M., Bayston, R., Brown, P.D., Winship, P.D. and Reid, H.J. 2004. Silver nanoparticles and polymeric medical devices: a new approach to prevention of infection? Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 54(6): 1019-24.

35.Govindaraju, K., Tamilselvan, S., Kiruthiga, V. and Singaravelu, G. 2010. Biogenic silver nanoparticles by Solanum torvum and their promising antimicrobial activity. Journal of Biopesticides, 3(1): 394-399.

36.Gardea-Torresdey, J.L., Tiemann, K. J., Gamez, G., Dokken, K., Tehuacanero, S. and Jose-Yacaman, M. 1999. Gold nanoparticles obtained by bio-precipitation from gold (iii) solutions. Journal of Nanoparticle Research, 1(3): 397-404.

37.Heidarpour, F., Wan, A.b., Karim Ghani, W. A., Fakhru’lRazi, A., Sobri, S., Heydarpour, V., Zargar, M. and Mozafari, M. R. 2010. Complete removal of pathogenic bacteria from drinking water using nano silver-coated cylindrical polypropylene filters. Clean Technologies and Environmental Policy, 13(3): 499-507.

38.Jassbi, A., Zare, S., Firuzi, O. and Xiao, J. 2015. Bioactive phytochemicals from shoots and roots of Salvia species. Phytochemy Reviews. Available from: http://dx.doi.org/10.1007 /s11101-015-9427-z.

39.Jassbi, A.R., Eghtesadi, F., Hazeri, N., Ma”somi, H., Valizadeh, J., Chandran J. N., Schneider, B. and Baldwin, I.T. 2017. The roots of Salvia rhytidea: a rich source of biologically active diterpenoids. Natural Product Research, 31(4): 477-481.

40.Kaushik Thakkar, N., Snehit Mhatre, S. and Rasesh Parikh, Y. 2010. Biological synthesis of metallic nanoparticles. nanomedicine, 6: 257-262.

41.Kaviya, S., Santhanalakshmi, J., Viswanathan, B., Muthumary, J. and Srinivasan, K. 2011. Biosynthesis of silver nanoparticles using Citrus sinensis peel extract and its antibacterial activity. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 79: 594-98.

42.Kim, J. S, Kuk, E., Yu, K. N., Kim, J-H., Park, S. J., Le, H.J., Kim, S.H., Park, Y.K., Park, Y. H., Hwanq, C.Y., Kim, Y.K., Lee, Y.S., Jeonq, D.H. and Cho, M.H. 2007. Antimicrobial effects of silver nanoparticles. Nanomedicine, 3(1): 95-101.

43.Mazaraie, A., Mousavi-Nik, S.M. and Fahmideh, L. 2018. Assessments of phenolic, flavonoid and antioxidant activity of aqueous, alcoholic, methanol and acetone extracts of thirteen medicinal plants. Nova Biologica Reperta, 4 (4): 299-309. (In Persian)

44.Mock, J.J., Barbic, M., Smith, D.R., Schultz, D.A. and Schultz, S. 2002. Shape effects in plasmon resonance of individual colloidal silver nanoparticles. The Journal of Chemical Physics, 116(15): 6755-59.

45.Mohasseli, T. and Pourseyyedi, Sh. 2015. Green synthesis and characterization of silver nanoparticles using seed aqueous extract of Sesame. Biotechnology Tarbiat Modares University, 1(6): 10-20. (In Persian)

46.Monteiro, D.R., Gorup, L.F., Takamiya, A.S., Ruvollo-Fiho, A.C., Carmago, E.R. and Barbosa, D.B. 2009. The growing importance of materials that prevent microbial adhesion. International Journal of Antimicrobial Agents, 34(2): 103-10.

47.Oliveria, J.R.D., Figueiredo Vilela, P.D.G., Aguiar Almeida, R.B.D., Oliveira, F.E.D., Talgo Carvalho, C.A., Afonso Camargo, S.E., Cardoso Jorge, A.O. and Oliveira, L.D.D. 2019. Antimicrobial activity of noncytotoxic concentrations of Salvia officinalis extract against bacterial and fungal species from the oral cavity. General dentistry, 434: 22-26.

48.Omidbaigi, R. 2005. Approaches to the production and processing of medicinal plants, Behnashr Publications, Mashhad, 1: 347-8.

49.Özogul, F., Polat, A. and Özogul, Y. 2004. The effects of modified atmosphere packaging and vacuum packaging on chemical, sensory and microbiological changes of sardines (Sardina pilchardus). Food Chemistry, 85(1): 49-57.

50.Özyurt, G., Kuley, E., Özkütük, S. and Özogul, F. 2009. Sensory, microbiological and chemical assessment of the freshness of red mullet (Mullus barbatus) and goldband goatfish (Upeneus moluccensis) during storage in ice. Food Chemistry, 114(2): 505-510.

51.Philip, D. 2009. Biosynthesis of Au, Ag and Au–Ag nanoparticles using edible mushroom extract. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy 2009; 73: 374-381.

52.Philip, D. 2010. Green synthesis of gold and silver nanoparticles using Hibiscus rosasinensis. Physica E, 42(5); 1417–24.

53.Praveen Kumar, K., Paul, W., Chandra, P. and Sharma, P. 2007. Green synthesis of gold nanoparticles with Zingiber officinale extract: Characterization and blood compatibility. Process Biochemistry, 46: 2007-2013.

54.Rimal Isaac, SR., Sakthivel, G. and Murthy, Ch. 2013. Green synthesis of gold and silver nanoparticles using averrhoa bilimbi fruit extract. Journal of Nanotechnology, 128(5): 89-101.

55.Salimpour, F., Mazooji, A. and Akhoondi Darzikolaei, S. 2011. Chemotaxonomy of six Salvia species using essential oil composition markers. Journal of Medicinal Plants Research, 5(9):1795-1805.

56.Salmanpour Ahmadi, H. A., Manouchehri, H. and Safari, R. 2016. Evaluation chitosan nanoparticles and nano-encapsulated thyme effect on microbial spoilage of Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) fillet inoculated with Listeria monocytogenes. Journal of Fisheries (Iranian Journal of Natural Resources), 68 (4): 577-587 (In Persian)

57.Shafizadeh, F. 2002. Medicinal plants of lorestan province, Hayian Publisher, Tehran.

58.Shankar, SS., Rai, A., Ahmad, A. and Sastry, M. 2002. Rapid synthesis of Au, Ag, and bimetallic Au core Ag shell nanoparticles using Neem (Azadirachta indica) leaf broth. Journal of Colloid and Interface Science, 275: 496-502.

59.Shekarforoush, S.S., Razavi Rohani, S.M., karim, G., Kiaie S.M.M., Rokni, N. and Abbasvali, M. 2013. Study on the overview on food borne bacteria in food with animal origin in Iran; Part three; Seafood. Journal of Food Hygine, 2(4): 15-32 (In Persian)

60.Shenya, D.S., Mathewa, J. and Philip, D. 2011. Phytosynthesis of Au, Ag and Au–Ag bimetallic nanoparticles using aqueous extract and dried leaf of Anacardiumoccidentale. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 79: 254-262.

61.Singh, P., Garg, A., Pandit, S., Mokkapati, V.R.S.S and Mijakovic, D. 2018. Antimicrobial effects of biogenic Nanoparticles. nanomaterials, 8, 1009; DOI: 10.3390/nano8121009.

62.Stobie, N., Duffy, B., McCormack, D. E., Colreavy, J., Hidalgo, M., McHale, P. and Hinder, S.J. 2008. Prevention of Staphylococcus epidermidis biofilm formation using a low - temperature processed silver - doped phenyltriethoxysilane sol - gel coating. Biomaterials, 29(8): 963–9.

63.Salari. S., Bakhshi, T., Sharififar, F., Naseri, A. and Ghasemi Nejad Almani, P. 2016. Evaluation of antifungal activity of standardized extract of Salvia rhytidea Benth. (Lamiaceae) against various Candida isolates. . Journal de Mycologie Médicale, 26(4): 323-330. Doi: 10.1016/j.mycmed.

64.Vallet-Regí, M., González, B. and Izquierdo-Barba, I. 2019. Nanomaterials as Promising alternative in the infection treatment. Internatioanl Journal of Molecular Sciences. 20, 3806; doi: 10.3390/ijms20153806

65.Vijayaraghavana, K., Mahadevana, A., Sathishkumara, M., Pavagadhia, S. and Balasubramaniana, R. 2011. Biosynthesis of Au (0) from Au (III) via biosorption and bioreduction using brown marine alga Turbinaria conoides. Chemical Engineering Journal, 167: 223–227.

66.Walker, J.B., Sytsma, K.J. 2007. Staminal evolution in the genus Salvia (Lamiaceae): molecular phylogenetic evidence for multiple origins of the lever. Annals of Botany, 100(2):375-391.

67.Wang, L., Hu, Ch. and Shao, L. 2017. The antimicrobial activity of nanoparticles: present situation and prospects for the future, International Journal of Nanomedicine, 12: 1227-1249.

68.Wang, Y., He, X., Wang, K., Zhang, X. and Tan, W. 2009. Barbated skull cup herb extract-mediated biosynthesis of gold nanoparticles and its primary application in electrochemistry. Colloids and surfaces B, Bio interfaces, 73: 75-79.

69.Yong Song, J., Hyeon-Kyeong, J. and Beom Soo, K. 2009. Biological synthesis of gold nanoparticles using Magnolia kobus and Diopyros kaki leaf extracts. Process Biochemistry, 44: 1133–1138.

70.Zahabi, Z.F., Sharififar, F., Almani, P.G.N. and Salari, S. 2020. Antifungal activity of different fractions of Salvia rhytidea Benth. as a valuable medicinal plant against various species of Candida in Kerman Province, southeast Iran, Gene Reports, https://doi.org/ 10.1016/j.genrep. 100624.

71.ZandiNavgaran, Kh., Naseri, L. and Esmaiili, M. 2014. Effect of packaging material containing nano-silver and silicate clay particles on postharvest quality attributes of sweet cherry cv. Syaahe Mashhad, Journal of Food Research, 24(1): 89-102 (In Persian)

72.Zarei, M., Jamnejad, A. and Khajehali, E. 2014. Antibacterial effect of silver nanoparticles against four foodborne pathogens. Jundishapur Journal of Microbiology, 7(1): 1-11.

73.Zarei, Z., Razmjoue, D. and Karimi, J. 2018. Investigating the bioavailability and antibacterial effect of silver nanoparticles produced by (Ferulago angulate Boiss.) extract. Journal of Jahrom University of Medical Scinces, 16 (1): 24-3462. (In Persian)

74.Zarei, G. and Morovvati Sharifabad, A. 2017. Essential oil composition of Salvia eremophila Boiss. In different stages of plant growth in Yazd province. Eco-phytochemical Journal of Medicinal Plants, 4(4): 74-84 (In Persian)